Заговор от незапланированных покупок
Бабульки-бабулечки, ласковые штулечки. Кэшачок погоди, кредитку изводи. Иже еси, вплоть до кассы пронеси. Лук порей от цен в глаза полей. Помилуй мне крепость от покупок не пресных да ни присных. От лукавой цифири, да лихой мотыри. Избави, укрепи растратства на цепи. Запряги по верному пути, эконома воплоти. Мурины заушив в лекалы поплевав, неси наставь, взгляд отведи. От мотовства всякаго, кривого да троякого. От сего часа по весь день, чтоб до сходу молова кошель вынуть лень.

Наговор на хорошую распродажу
А как встану я вместе с зарею, за копейку на рупь нарою. Пойду с ранним солнышком по верхам до донышка. Найду вход огромный, а за ним клад скоромный. Лежат всяко злато ценой не богато. Набери полны закрома, все одно – задарма. Отворю суму, все себе возьму. А кто кладец клал, обо мне мечтал. Что приду я утром с солнышком и возьму что положено. На зубок алтын, чтобы мой аршин. Будет груз богат, и буду рад. Легким перышком, тонкой щепочкой, его унесу, у закрытья на носу. Гуччи-гуччии, га-га-га, все размеры, да-да-да.

ХРАМ СВЯТИТЕЛЯ ЧУДОТВОРЦА НИКОЛАЯ НА ВОДАХ

10 сентября день памяти преподобного Моисея Мурина, иеромонаха (ок. 400)

От бандита до Преподобного

Валерия Михайлова

Преподобный Моисей Мурин

Этому святому молятся заключенные, ищущие жизни по вере, и горькие пьяницы, желающие разрешиться от тяжкого недуга. Темнокожие христиане Америки избрали его своим покровителем: так, именно «Братство преподобного Моисея Черного» занимается православной миссией среди афроамериканцев.

Так кем же был святой Моисей Мурин?

Разбойником: мы все знаем, что он был разбойником и стал монахом. Но… неужели это так просто: быть почти животным, насильником, головорезом — и вдруг покаяться и стать святым? Какой привычной стала для нас эта житийная связка: был, стал, грешил, принес покаяние… Вот и посмотрим свежим взглядом на удивительную историю этого человека.

Однажды ночью

Моисей родился в IV веке в Египте. В то время эти земли входили в состав Римской, а затем Восточно-Римской империи. До ислама еще несколько веков, христианство широко распространено — по преданию сам апостол Марк впервые принес сюда весть о Распятом и Воскресшем. Египетские христиане пережили гонения Диоклетиана, бушевавшие по всей империи. В пустынных местах основаны первые монастыри, где люди несут подвиг выше человеческих сил. Впрочем, и язычество еще не отступило в глубину веков.

Моисей становится главой шайки разбойников

Моисей — раб знатного человека, возможно, чиновника. Этот раб — около 2 метров ростом, косая сажень в плечах, и его отличают совсем не мирные наклонности. То ли за пьянство и воровство, то ли и вовсе за убийство Моисея выгоняют вон. И он находит свое место в шайке разбойников, становится их главой.

Несколько лет грабежа, разбоя, насилия, убийств… Но однажды все меняется: возможно, очередное злодеяние пробуждает в нем совесть. И в одну из ночей Моисей смотрит на звездное небо, задумывается, глубоко вздыхая о Боге и о своей жизни. И вдруг чувствует Его присутствие…

Этого было достаточно.

Разбойник оставляет свою банду, уходит в пустыню, и вот — он уже стоит перед дверьми монастыря. Стоит на коленях под палящим солнцем, просит впустить его. Братия знала, кто к ним пришел: слава Мурина распространилась повсеместно. Знали и… приготовились к смерти: совершили Литургию, причастились. Перед их дверьми неотступно стоял настоящий бандит, способный, как говорит житие, в одиночку голыми руками справиться с несколькими вооруженными людьми.

Моисей потерял сознание от жары. Только тогда игумен начал догадываться, зачем пришел этот изверг. Разбойника внесли в помещение. Придя в себя, он сказал только: «Исповедуй меня, отче».

Исповедь была страшной

Исповедь была страшной и длилась очень долго. После нее Моисей стал жить в числе братии, принявшей его так недоверчиво поначалу.

Думал ли он, примет Бог его покаяние или не примет? Примут его братия или нет? И сколько людей думает об этом: «Меня Бог не примет — я в жизни такого понаделал!» Но в нем была решимость, которая, по слову святых отцов, одна и отделяет святого от обычного человека.

«Не ходите к этому лживому монаху!»

Бывшему бандиту назначили самые тяжелые и неприятные послушания. Он выполнял их и втайне, ночью, делая тяжелую работу за других монахов, приносил воду старцам в отдаленные кельи.

Прошло несколько лет, и игумен благословил монаха подвизаться отдельно. Там на него впервые и напали бывшие соратники — конечно, не подозревая, с кем имеют дело. Моисей в одиночку связал четверых разбойников и на своих плечах отнес к ногам игумена. Тот велел развязать и отпустить их. И пораженные всем произошедшим, бандиты… пожелали остаться в числе братии.

Моисей Мурин не забывал, кто он, кем он был. И прежние привычки не давали себя забыть: как и преподобная Марии Египетская, он долго и жестоко боролся с блудной страстью. С гневом. Со своим неистовым нравом. И как ему давалась эта борьба, мы можем только догадываться.

Молва о подвижнике распространяется быстро. Моисея пытались разыскать слуги знатного человека, чтоб организовать встречу с «высокодуховным лицом». «Не стоит ходить к этому лживому, недостойному монаху», — сказал он этим слугам, встретив их по дороге.

Его смирение решил проверить епископ перед тем, как рукоположить в священный сан. Он попросил мальчишек-алтарников искусить подвижника. Те стали дразнить Моисея, попрекать его цветом кожи, кричать, что он недостоин переступить порог алтаря. И тот встал перед детьми на колени и сказал: «Вы даже не подозреваете, насколько я недостоин не то что переступить порог алтаря, но даже порог церкви!»

«Все, взявшие меч, мечом погибнут»

Преподобный Моисей Мурин

Смерть Моисей Мурин встретил такую, о которой молил. Совсем не «мирную», но точно «непостыдную».

Помните, у старца Паисия есть рассказ о престарелом подвижнике, который сгорел заживо у себя в келье от уголька из печки? Вся братия монастыря была в смятении, не понимая, как Бог попустил такое. А потом открылось, что подвижник молил Бога умереть именно так, потому что в молодые годы сам сжег заживо в печи одного турка.

Моисей молил, чтобы за все его убийства убили и его: «Я много лет ожидаю времени, когда на мне исполнится слово Владыки моего, Господа Иисуса Христа, сказавшего: “Все, взявшие меч, мечом погибнут”». Предупредив братию о том, что на монастырь вскоре нападут разбойники, подвижник остался молиться и ждать своего часа. Вместе с ним осталось несколько его учеников. Все они были убиты. Это произошло около 400 года…

Жаль, что о Моисее Мурине мы знаем мало. Его подробное житие не зачитывается в храмах. Но он — не меньше, чем преподобная Мария, подвизавшаяся в тех же пустынях.

Каково изменить своим многолетним привычкам? Каково просить о наказании, когда ты прощен? Как все это приложимо к нашей обыденной жизни, не изобилующей ни смертными грехами, ни пламенным покаянием? Впрочем, в одном ему точно можно подражать. На любой порыв к осуждению — сказать, как преподобный Моисей: «Я несу дырявый мешок с грехами. Мои грехи сыплются сзади меня, и я не вижу их — а пришел, чтобы судить другого…»

Валерия Михайлова

Молитва преподобному Моисею Мурину

Преподобный Моисей Мурин — покаявшийся убийца и разбойник — помощник в трезвости и целомудрии. Ему молятся для преодоления страсти пьянства и блуда, и также об обращении ко Христу душ, согрешивших тяжкими преступлениями.

***

Тропарь преподобному Моисею Мурину, глас 1

Пустынный житель, и в телеси Ангел, и чудотворец явился еси, богоносе отче наш Моисее: постом, бдением, молитвою Небесная дарования приим, исцеляеши недужныя и души верою приходящих ти. Слава Давшему тебе крепость, слава Венчавшему тя, слава Действующему тобою всем исцеления.

Кондак преподобному Моисею Мурину, глас 4

Мурины заушив и лица демонов поплевав, мысленно просиял еси, якоже солнце светлое, светом жития твоего и учением наставляя души наша.

Молитва первая преподобному Моисею Мурину

О преподобный, ты от тяжких грехов достиг пречудных добродетелей, помоги молящимся тебе рабам Божиим (имена), влекомым в погибель оттого, что предаются безмерному, вредному для души и тела употреблению вина. Склони на них свой милостивый взор, не отклони и не презри их, но внемли им, прибегающим к тебе. Моли, святой Мо­исей, Владыку Христа, чтобы не отверг их Он, Милосердный, и да не возрадуется диавол их погибели, но да пощадит Господь этих безсильных и несчастных, которыми овладела пагубная страсть пиянства, ведь мы все Божии создания и искуплены Пречистою Кровию Сына Его. Услышь же, преподобный Моисей, их молитву, отгони от них диавола, даруй им силу победить страсть, помоги им, простри твою руку, выведи их на путь добра, освободи их от рабства страстей и избавь их от винопития, чтобы они, обновленные, в трезвении и светлом уме возлюбили воздержание и благочестие, и вечно прославляли Всеблагого Бога, всегда спасающего Свои создания. Аминь.

Молитва вторая преподобному Моисею Мурину

О, великая сила покаяния! О, неизмеримая глубина милосердия Божия! Ты, преподобный Моисей, был прежде разбойником, но потом ужаснулся своих грехов, восскорбел о них и в раскаянии пришел в монастырь и там в великом плаче о своих беззакониях и в трудных подвигах проводил свои дни до кончины и удостоился Христовой благодати прощения и дара чудотворения.

О, преподобный, ты от тяжких грехов достиг пречудных добродетелей, помоги и молящимся тебе рабам Божиим (имена), влекомым в погибель от того, что предаются безмерному, вредному для души и тела употреблению вина. Склони на них свой милостивый взор, не отклони и не презри их, но внемли им, прибегающим к тебе.

Моли, святой Моисей, Владыку Христа, чтобы не отверг их Он, Милосердный, и да не возрадуется диавол их погибели, но да пощадит Господь этих безсильных и несчастных (имена), которыми овладела пагубная страсть пьянства, ведь мы все Божии создания и искуплены Пречистою Кровью Сына Его. Услышь же, преподобный Моисей, их молитву, отгони от них диавола, даруй им силу победить их страсть, помоги им, простри твою руку, выведи их на путь добра, освободи их от рабства страстей и избавь их от винопития, чтобы они, обновленные, в трезвении и светлом уме, возлюбили воздержание и благочестие и вечно прославляли Всеблагого Бога, всегда спасающего Свои создания. Аминь.

***

Житийная и научно-историческая литература о преподобном Моисее Мурине:

Преподобному Моисею Мурину. Молитвы от пьянства и всякой страсти 

Молитва преподобного моисея мурина

Чудотворные слова: молитва преподобного моисея мурина в полном описании из всех найденных нами источников.

Молитвы святым

Молитва преподобному Моисею Мурину

Память: 28 августа / 10 сентября

Преподобный Моисей Мурин – покаявшийся убийца и разбойник – помощник в трезвости и целомудрии. Ему молятся для преодоления страсти пьянства и блуда, и также об обращении ко Христу душ, согрешивших тяжкими преступлениями.

Тропарь преподобному Моисею Мурину, глас 1

Пустынный житель, и в телеси Ангел, и чудотворец явился еси, богоносе отче наш Моисее: постом, бдением, молитвою Небесная дарования приим, исцеляеши недужныя и души верою приходящих ти. Слава Давшему тебе крепость, слава Венчавшему тя, слава Действующему тобою всем исцеления.

Кондак преподобному Моисею Мурину, глас 4

Мурины заушив и лица демонов поплевав, мысленно просиял еси, якоже солнце светлое, светом жития твоего и учением наставляя души наша.

Молитва первая преподобному Моисею Мурину

О преподобный, ты от тяжких грехов достиг пречудных добродетелей, помоги молящимся тебе рабам Божиим (имена), влекомым в погибель оттого, что предаются безмерному, вредному для души и тела употреблению вина. Склони на них свой милостивый взор, не отклони и не презри их, но внемли им, прибегающим к тебе. Моли, святой Мо­исей, Владыку Христа, чтобы не отверг их Он, Милосердный, и да не возрадуется диавол их погибели, но да пощадит Господь этих безсильных и несчастных, которыми овладела пагубная страсть пиянства, ведь мы все Божии создания и искуплены Пречистою Кровию Сына Его. Услышь же, преподобный Моисей, их молитву, отгони от них диавола, даруй им силу победить страсть, помоги им, простри твою руку, выведи их на путь добра, освободи их от рабства страстей и избавь их от винопития, чтобы они, обновленные, в трезвении и светлом уме возлюбили воздержание и благочестие, и вечно прославляли Всеблагого Бога, всегда спасающего Свои создания. Аминь.

Молитва вторая преподобному Моисею Мурину

О, великая сила покаяния! О, неизмеримая глубина милосердия Божия! Ты, преподобный Моисей, был прежде разбойником, но потом ужаснулся своих грехов, восскорбел о них и в раскаянии пришел в монастырь и там в великом плаче о своих беззакониях и в трудных подвигах проводил свои дни до кончины и удостоился Христовой благодати прощения и дара чудотворения.

О, преподобный, ты от тяжких грехов достиг пречудных добродетелей, помоги и молящимся тебе рабам Божиим (имена), влекомым в погибель от того, что предаются безмерному, вредному для души и тела употреблению вина. Склони на них свой милостивый взор, не отклони и не презри их, но внемли им, прибегающим к тебе.

Моли, святой Моисей, Владыку Христа, чтобы не отверг их Он, Милосердный, и да не возрадуется диавол их погибели, но да пощадит Господь этих безсильных и несчастных (имена), которыми овладела пагубная страсть пьянства, ведь мы все Божии создания и искуплены Пречистою Кровью Сына Его. Услышь же, преподобный Моисей, их молитву, отгони от них диавола, даруй им силу победить их страсть, помоги им, простри твою руку, выведи их на путь добра, освободи их от рабства страстей и избавь их от винопития, чтобы они, обновленные, в трезвении и светлом уме, возлюбили воздержание и благочестие и вечно прославляли Всеблагого Бога, всегда спасающего Свои создания. Аминь.

Житийная и научно-историческая литература о преподобном Моисее Мурине:

• Житие преподобного Моисея Мурина, Эфиопского, иеромонаха – Храм Всех Святых на Кулишках
• Преподобный Моисей Мурин – Православие. Ru

Читать другие молитвы раздела «Православный молитвослов»

Читайте также:

© Миссионерско-апологетический проект «К Истине», 2004 – 2017

При использовании наших оригинальных материалов просим указывать ссылку:

Когда нужно читать православную молитву святому Моисею Мурину

Глядя на икону Моисея Мурина, мы видим темнокожего мужчину, что уже само по себе удивляет многих, хотя Господь не смотрит на цвет кожи и расовую принадлежность, когда дает свою благодать, Ему важны чистое сердце и искренняя вера. Именно этими качествами, вкупе с глубоким покаянием и непрестанной слезной молитвой святой Моисей Мурин снискал от Бога благодать исцелений.

Жизнеописание преподобномученика Моисея поразительно. В молодости он был рабом, но совершил убийство, о чем стало известно его хозяину. Хозяин был незлобным человеком, и не отдал св. Моисея под суд, а прогнал. У молодого человека появился шанс начать новую жизнь, но вместо этого он примкнул к разбойникам, начал грабить, убивать, пьянствовать и предаваться блудной страсти. Однако вскоре в жизни святого Моисея Мурина произошел переворот.

Православные молитвы преподобного Моисея Мурина побеждают бесов

Спустя несколько лет такой бесчестной жизни Моисей покаялся и ушел в монастырь с твердым намерением избавиться от страстей. Однако это оказалось очень нелегко.

Несмотря на постоянную молитву, святой Моисей Мурин был днем и ночью одолеваем блудной страстью. Много ему пришлось перетерпеть скорбей – болезни, и физические нападения бесов, пока эта страсть не оставила его. После этого христианские молитвы прп. св Моисея стали чудодейственными, и о нем узнали люди. Однако он не поддался гордыне, и до конца дней продолжал считать себя самым грешным и недостойным монахам, даже когда сам стал духовным наставником.

Кроме того, за свою сильную молитву святому Моисей Мурин получил от Бога прозорливость. Сам он и предсказал свою скорую смерть от разбойников, напавших на монастырь. Предвидя мученический конец своей жизни, он тем не менее отказался покинуть обитель, и вместе с 6-ю учениками погиб в 405 году.

Чудотворная молитвы преподобному Моисею Мурину помогают от пьянства

Сегодня текст молитвы свт. Моисею Мурину читают те, кто хочет исцелиться от страсти пьянства, наркомании, блуда – всех грехов, которые сопутствуют распущенному образу жизни. Очень рекомендуется читать молитву преподобномученику также родственникам тех, кто попал в сети этих тяжких страстей. Для этого необходимо купить икону св. Моисея Мурина в православном храме или интернет-магазине.

Слушать на видео молитву святому Моисею Мурину от пьянства и алкоголизма

Текст сильной молитвы от пьянства и наркомании святому Моисею Мурину

О великая сила покаяния! О, неизмеримая глубина милосердия Божия! Ты, преподобный Моисей, был прежде разбойником, но потом ужаснулся своих грехов, воскорбел о них и в раскаянии пришел в монастырь и там в великом плаче о своих беззакониях и в трудных подвигах проводил свои дни до кончины и удостоился Христовой благодати прощения и дара чудотворения. О, преподобный, ты от тяжких грехов достиг пречудных добродетелей, помоги и молящимся тебе рабам (имена), влекомым в погибель от того, что предаются безмерному, вредному для души и тела употреблению вина. Склони на них свой милостивый взор, не отклони и не презри их, но внемли им, прибегающим к тебе. Моли, святой Моисей, Владыку Христа, чтобы не отверг их Он, Милосердный, и да не возрадуется диавол их погибели, но да пощадит Господь этих бессильных и несчастных (имена), которыми овладела пагубная страсть пьянства, ведь мы все Божьи создания и искуплены Пречистой Кровью Сына Его. Услышь же, преподобный Моисей, их молитву, отгони от них диавола, даруй им силу победить их страсть, помоги им, простри твою руку, выведи их на путь добра, освободи их от рабства страстей и избавь их от винопития, чтобы они обновленные, в трезвении и светлом уме возлюбили воздержание и благочестие и вечно прославляли Всеблагого Бога, всегда спасающего свои создания. Аминь.

Икона Моисею Мурину.

Молитвы преподобному Моисею Мурину.

О, преподобне, ты от тяжких грехов достигл пречудных добродетелей! Помози и молящимся тебе рабом Божиим (имя рек), влекомым в погибель от безмернаго вина употребления, повреждающаго безсмертную душу и тело – храм Духа Святаго. Склони на них свой милостивый взор и не презри их, но внемли им, прибегающим к тебе.

Моли, святе Моисее, Владыку Христа, чтобы Он, Милосердый, не отверг их безсильных и несчастных, которыми овладела страсть чрезмернаго винопития, и не возрадовался бы диавол их погибели, ибо все мы, как создания Божии, искуплены Пречистой Кровию Сына Его. Услышь же, преподобне Моисее, молитву их и нашу. Отгони от них диавола даруй им силу победить их страсть, приведи их на путь добра, освободи от рабства страстем, избавь от пагубы безмернаго винопития, дабы, обновленнии, в духовном трезвении и светлом уме, возлюбили они всяческое воздержание и благочестие и вечно прославляли спасающаго всегда создания Свои Всеблагаго Бога, Емуже подобает слава, честь и поклонение во веки веков. Аминь.

О, великая сила покаяния! О, неизмеримая глубина милосердия Божия! Ты, преподобне Моисее, был прежде разбойником, но потом ужаснулся своих грехов, возскорбел о них и в раскаянии пришел в монастырь, и там в великом плаче о своих бывших беззакониих и в трудных подвизех поста и молитвы проводил дни свои до кончины, и удостоился Христовой благодати прощения и дара чудотворения.

Тропарь преподобному Моисею Мурину

Пустынный житель, и в телеси Ангел, и чудотворец явился еси, Богоносне отче наш Моисее: постом, бдением, молитвою небесная дарования приим, исцеляеши недужныя и души верою приходящих ти. Слава Давшему тебе крепость, слава Венчавшему тя, слава Действующему тобою исцеления.

Мурины заушив, и лица демонов поплевав, мысленно просиял еси, якоже солнце светло, светом жития твоего и учением наставляя души наша.

В тебе, отче, известно спасеся еже по образу: приим бо Крест последовал еси Христу, и дея учил еси презирати убо плоть, преходит бо, прилежати же о души, вещи бессмертней. Темже и со ангелы срадуется, преподобне Моисее, дух твой.

Популярные молитвы:

Молитвы святителю Гурию Казанскому и Варсонофию Тверскому, чудотворцу

Молитва преподобному Иакову Железноборскому

Молитва Пресвятой Богородице Неупиваемая Чаша

Молитва святому Вонифатию Милостивому

Молитвы святителю Спиридону Тримифунтскому чудотворцу

Молитва преподобной Афанасии

Молитва святителю Митрофану Воронежскому

Молитва святому преподобному Иоанну Кущнику

Молитва святому преподобному Иоанну Печерскому

Молитва мученикам Александру и Антонине

Молитва святителю Евфимию, архиепископу Новгородскому, чудотворцу

Молитвы преподобному Макарию Великому, Египетскому

Молитва Пресвятой Богородице Нечаянная Радость

Молитва преподобному Иосифу Волоцкому

Молитвы об исцелении от пьянства лучше всего обращать к преподобному Моисею Мурину и мученику Вонифатию Милостивому.

Молитва Святому мученику Вонифатию от пьянства среди христиан считается одной из самых действенных.

Тысячи людей ежедневно обращаются к нему с просьбой об излечении и многие действительно встают на путь выздоровления. Кроме этой молитвы, существует еще несколько, столь же действенных. И так-же как молитва Святому Вофантию они, молитвы, применяются от алкоголизма.

История святого мученика началась в Риме, где он жил в рабстве у знатной римлянки. Вместе они предавались винопитию и разврату, но души их мучились осознанием греха.

Узнав, что мощи святых мучеников, хранимые в доме, могут помочь в спасении души, хозяйка отправила Вонифатия, чтобы он раздобыл и привез их.

В пути Вонифатий искренне раскаялся в грехах, усердно молился и просил Господа дать ему испытание, чтобы пострадать за веру. Так и случилось – по прибытии в город Тарс он принял мученическую смерть за свою веру и с тех пор считается заступником пред Господом за всех пьяниц и блудников.

Именно Святому мученику Вонифатию от пьянства молятся и сами страдающие этим недугом, и их близкие.

Молитвы об исцелении от пьянства лучше всего обращать к преподобному Моисею Мурину и мученику Вонифатию Милостивому.

Молитва преподобному Моисею Мурину:

«О, преподобный, ты от тяжких грехов достиг пречудных достиг пречудных добродетелей, помоги молящимся тебе рабам Божиим (имена), влекомым в погибель оттого, что предаются безмерному, вредному для души и тела употреблению вина. Склони на них свой милостивый взор, не отклони и не презри их, но внемли им, прибегающим к тебе. Моли, Святой Моисей, Владыку Христа, чтоб не отверг их. Он, Милосердный, и да не возрадуется Диа-вол их погибели, но да пощадит Господь этих бессильных и несчастных, которыми овладела пагубная страсть пьянства, ведь мы все божественные создания и искуплены Пречистою Кровию Сына Его. Услыши же, преподобный Моисей, их молитву, отгони от них Диавола, даруй им силу победить страсть, п омоги им, простри свою руку, выведи их на путь добра, освободи их от рабства страстей и избавь их от рабства винопития, чтобы они, обновленные, в трезвении и светлом уме возлюбили воздержание и благочестие и вечно прославляли Всеблагого Бога, всегда спасающего Свои создания. Аминь».

«Во имя Отца и Сына и Святого Духа, аминь. Хмель и вино, отступись от раба Божьего (имя) в темные леса, где люди не ходят и кони не бродят, и птица не летает.Во имя Отца и Сына и Святого Духа (дважды произнести), хмель и вино, выходи на быструю воду, на которой люди не ездят. От раба Божьего (имя), хмель и вино, поди на буйные ветры, от которой ветер по дальности ходит.Во имя Отца и Сына и Святого Духа привяжись к лихому человеку, который на раба Божьего (имя) лихо думает, плохо смотрит, мимо ходит, к тому привяжись, который добра не сделает, от меня во веки веков отвяжись. Слово мое кр епко, дело мое лепко. Во имя Отца и Сына и Святого Духа. Аминь».

О, всесвятый Вонифатие, милостивый раб Милосердаго Владыки! Услыши прибегающих к тебе, одержимых пагубным пристрастием к винопитию и как в своей земной жизни ты никогда не отказывал в помощи просящим тя, так и теперь избави этих несчастных (имена).

Некогда, богомудрый отец, град побил твой виноградник, ты же, воздав благодарение Богу, велел немногие сохранившиеся грозды положйти в точиле и позвати нищих. Затем, взяв новое вино, ты разлил его по каплям во все сосуды, бывшие в епископии, и Бог, исполняющий молитву милостивых, совершил преславное чудо: вино в точиле умножилось, и нищие наполнили свои сосуды. О, святителю Божий!

Как по твоей молитве умножилось вино для нужд церкви и для пользы убогих, так ты, блаженный, уменьши его теперь там, где оно приносит вред, избави от пристрастия к нему предающихся постыдной страсти винопития (имена), исцели их от тяжкого недуга, освободи от бесовского искушения, утверди их, слабых, дай им, немощным, крепость и силу благоуспешно перенести это искушение, возврати их к здоровой и трезвой жизни, направи их на путь труда, вложи в них стремление к трезвости и духовной бодрости.

Помоги им, угодник Божий Вонифатие, когда жажда вина станет жечь их гортань, уничтожи их пагубное желание, освежи их уста небесною прохладою, просвети их очи, постави их ноги на скале веры и надежды, чтобы, оставив свое душевредное пристрастие, влекущее за собой отлучение от Небеснаго Царствия, они, утвердившися в благочестии, удостоились непостыдной мирной кончины и в вечном свете бесконечного Царства Славы достойно прославляли Господа нашего Иисуса Христа со Безначальным Его Отцем и с Пресвятым и Животворящим Его Духом во веки веков. Аминь.

Прежде чем читать молитву Святому мученику, желательно попросить благословения у священника. Отчитывать такую затяжную болезнь как пьянство, придется от 40 дней до 40 недель. Молясь нужно обязательно думать о человеке, за которого просите.

Помимо Св. Вонифатия, молиться об исцелении от запоев принято Преподобному Моисею Мурину. Он был пьяницей и жестоким разбойником, но однажды глубоко раскаялся, ушел в монахи и всю оставшуюся жизнь провел в молитвах и трудах, наставляя на путь истинный таких же грешников, каким в молодости был сам.

Не менее почитаема у православных чудотворная Икона Божией Матери «Неупиваемая чаша». Также как и молитва Святому мученику Вонифатию от пьянства, обращение к этой иконе помогает верующим исцелиться от тяжкого недуга и укрепить веру.

Часть 5 – МОЛИТВЫ ОТ ПЯНСТВА СВ. МУРИЮ И СВ. ВОНИФАТИЮ

Православная молитва Моисею Мурину от пьянства

На иконе Моисей изображается с темным лицом не случайно — он араб, родом из Эфиопии, жил в Египте. Приставка «мурин», добавленная к имени, тоже имеет объяснение: мурин — означает черный. Он был слугой знатного человека, но после того как Моисей совершил убийство, хозяин выгнал его. Он примкнул к шайке разбойников и продолжал совершать преступления. Жил он в блудном грехе, постоянно страдая от пьянства. Спустя несколько лет такой жизни, он раскаялся и ушел в пустынную обитель. Все дни Моисей Мурин проводил в самостоятельных молитвах, прося прощения за содеянные злодеяния. Однако искусительные мысли продолжали одолевать его во снах. Тогда, чтобы победить демона-искусителя, святой Моисей Мурин стал читать молитвы и ночью. Шесть лет подряд, каждую ночь он стоял во всенощном бдении. Наградой ему за долготерпение и упорство стал дар властвовать над бесами.

Чудотворная молитва преподобного Моисея Мурина от пьянства

Многие люди страдают от алкогольной зависимости. Степень пьянства у каждого своя. Один,- выпив, может остановиться сам; второй,- остановиться может лишь в том случае, когда в доме заканчивается спиртное; третьему для протрезвления требуется помощь врача. Есть совсем опустившиеся люди, которые выпивают не одну бутылку водки в день. Опухшее лицо, красные глаза, неприятный запах перегара, дрожание рук, проблемы с давлением, головная боль – именно в таком виде начинается утро у любителей выпивки. Некоторые, не признают себя пьяницами: «Ну какой же я алкоголик? Алкоголики пьют водку, а я всего лишь пиво, и то две бутылки в день» Таким людям надо хотя бы самим для себя осознать проблему и признать, что она есть. Если вам каждый день требуется спиртное, при этом не важно, что вы пьете: виски, водку, пиво, вино, коктейли – вы алкоголик. Признав наличие у себя проблемы,- справиться с ней будет легче. Ведь теперь вы знаете врага в лицо. Начните бороться. Поначалу будет сложно, но молитва Моисея Мурина и сам пример его жизни, помогут вам избавиться от алкоголизма.

Сильная молитва преподобному Моисею Мурину.

Если рядом с вами человек, который пьет, но сам ничего не делает для того, чтобы бросить,- читайте за него христианскую молитву преподобному Моисею Мурину от винопития. Этому святому молятся и для избавления от других пагубных страстей. Православной молитвой святому Моисею Мурину просят об обращении к Христу душ, совершивших тяжкие преступления.

Текст православной молитвой Моисею Мурину

О, великая сила покаяния! О, неизмеримая глубина милосердия Божия! Ты, преподобне Моисей, был прежде разбойником, но потом ужаснулся своих грехов, возскорбел о них, и в раскаянии пришел в монастырь, и там в великом плаче о своих бывших беззакониих и в трудных подвигах проводил дни свои до кончины, и удостоился Христовой благодати прощения и дара чудотворения. О, преподобне, ты от тяжких грехов достиг пречудных добродетелей! Помози и молящимся тебе рабом Божиим (имена), влекомым в погибель от того, что предаются безмерному, вредному для души и тела употреблению вина. Склони на них свой милостивый взор и не презри их, но внемли им, прибегающим к тебе. Моли, святе Моисей, Владыку Христа, чтобы не отверг их Он, Милосердный, и да не возрадуется диавол их погибели, но да пощадит Господь этих безсильных и несчастных (имена), которыми овладела пагубная страсть пьянства, ведь мы все Божии создания и искуплены Пречистой Кровию Сына Его. Услышь же, преподобный Моисей, их молитву, отгони от них диавола, даруй им силу победить их страсть, помоги им, простри твою руку, выведи их на путь добра, освободи от рабства страстей и избавь от их от винопития, чтобы они, обновленные, в трезвении и светлом уме, возлюбили воздержание и благочестие, вечно прославляли Всеблагого Бога, всегда спасающего Свои создания. Аминь.

Молитвы об исцелении от пьянства и других зависимостей — Против искушений, нечистой силы и душевных болезней

Краткое житие

Вонифатий жил в III веке нашей эры. Был слугой римской аристократки Аглаи и управлял обширным имением римлянки. Мученик отличался добрым нравом: помогал нищим и обездоленным, раздавал милостыню и имел щедрое сердце. Однако, несмотря на эти благие качества, обладал привязанностью к вину и блуду. У управляющего возникла греховная плотская связь с его хозяйкой, Аглаей.

Знатная римлянка тяготилась неправедной жизнью и искала светоч истины. И вскоре Аглая обрела его в христианской вере. Стремясь к покаянию, она решила приобрести мощи мучеников, подвергавшихся в то время гонениям императора Диоклетиана, чтобы удостоиться небесного заступничества святых. Для этого женщина решила отправить слугу Вонифатия в Малую Азию, где в то время гибло много христиан, чтобы вывезти оттуда священные останки. Перед отъездом будущий святой спросил, будет ли Аглая столь же ревностно почитать его собственное тело, если он примет смерть за Христа. Однако римлянка посчитала сказанное шуткой и велела скорее возвращаться с мощами.

Вскоре Вонифатий достиг заветной цели и оказался в городе Тарс. Там в то время происходили жестокие гонения на христиан. Прибыв в город, римлянин стал свидетелем страшных истязаний мучеников. Несчастных четвертовали, травили дикими хищниками и бичевали. Однако христиане сохраняли верность истинному Богу.

Происходящее до глубины души потрясло Вонифатия. Он отважно бросился к ногам мучеников, умоляя их о заступничестве перед ликом Иисуса. Бывший грешник поспешил заявить, что теперь является христианином. Его сразу повлекли на суд, где он отказался служить идолам и твердо стоял в вере, поэтому подвергся пыткам.

Страдальца долго мучили. Согласно сохранившимся житиям, Вонифатия бросали в кипящий котел, лили в рот расплавленный металл, загоняли под ногти острые щепы. Но мученик терпеливо переносил истязания, прославляя Иисуса. Когда власти убедились в твердости римлянина, то вынесли смертный приговор. С искренней молитвой Богу Вонифатий принял казнь.

Спутники святого не знали о произошедшем и искали предводителя по всему городу, пока не встретили родственника местного палача, который поведал им о состоявшейся казни. Изумленные римляне прибыли в указанное место, и обнаружили останки Вонифатия. Они выкупили мощи и отвезли в столицу.

Аглая же удостоилась явления ангела Господня, велевшего с почетом принять тело мученика. Женщина торжественно встретила останки бывшего слуги. Позднее, в честь мученика Вонифатия Аглая построила в пригороде церковь, в которой были погребены мощи святого. Здесь происходили чудеса по молитве мученика: многочисленные исцеления, спасение христиан, дарование Божественной помощи. Сама Аглая стала вести праведную жизнь, раздала имущество и исполнилась дара чудотворения. День памяти святого мученика – 1 января.

Сила молитв святому Вонифатию

Мученик прославлен как великий помощник в избавлении от плотских страстей и зависимостей. Молитва этому святому очень сильная. По заступничеству мученика Бог дарует грешникам здравие, чистый рассудок, крепкую семью и большую любовь. Вонифатию молятся, дабы излечиться от пьянства, наркомании, чревоугодия, курения, похоти, душевных и телесных недугов.

В России частицы мощей святого мученика хранятся в нескольких храмах в Москве: в церкви святых бессеребренников Дамиана и Косьмы, в Крылатском храме Рождества Богородицы. Служители этих мест бережно хранят истории о помощи святого православным христианам. Всех чудес исцелений не перечислить. Люди приходят в храм и просят святого о помощи.

Для того чтобы Вонифатий исцелил страждущих, важно поверить в помощь мученика. Надежда и любовь всегда вознаграждаются. Если сам человек не в силах прибегнуть к Богу, то крест заботы и молитвенной помощи лежит на плечах близких – семьи и друзей.

Как правильно читать молитвы и акафист от пьянства

Обращаясь Богу, человек призывает к действию великую и грозную силу. Поэтому нужна осторожность в мыслях и чувствах. Существует ряд правил, соблюдаемых при молитвах о зависимых.

Главное условие помощи высших сил – это искренняя и чистая вера. Нельзя рассуждать будто язычник, задабривая Небеса. Бог видит душу человека и ждет сердечного, правдивого обращения. Таковое возможно исключительно в тех случаях, когда христианин смиренно уповает на волю Божью. Люди прибегают к духовной помощи для избавления от пагубной привычки членов собственной семьи: мужа, сына, брата.

Молиться можно как в храме, так и в домашней атмосфере. Но очень полезно перед началом задуманного, посетить церковь, побеседовать с батюшкой, взять благословение. Возможно, беседа со священником прольет свет на причины болезненной привязанности. Ведь нередко алкоголизм – это наказание за тяжкие прегрешения семьи или самого человека. Также в церкви заказывают молебен святым, помогающим в борьбе с зависимостями.

Привлекать самого зависимого можно только с его согласия. Нельзя принуждать к молитве. Но если человек согласен, то будет полезным сходить с ним в храм, чтобы он исповедался, раскаялся в своем грехе. Желательно, чтобы болящий отстоял три службы, затем выдержал пост. Хорошо, если он сам будет о себе молиться или будет присоединяться к тем, кто о нем просит Бога.

Для исполнения молитвенного правила необходима икона святого Вонифатия. Желательно зажигать церковные свечи, лампаду. Во время молитвы не отвлекаются на домашние хлопоты или отстраненные размышления. Нужно сконцентрироваться на чувстве любви и желании помочь тому, о ком молятся.

Обращаться к Богу с целью исцеления от пьянства нужно только по мужским дням: понедельник, вторник, четверг. В воскресение и дни больших церковных праздников Бога прославляют и благодарят, поэтому молиться о зависимых не следует.

Чтение молитв сопровождается употреблением святой воды. Освященная вода дает человеку силы для борьбы с внутренними демонами, оздоравливает тело и дух.

Преподобному Моисею Мурину

Тропарь, глас 8-й

В тебе, отче, известно спасеся еже по образу: приим бо Крест последовал еси Христу, и дея учил еси презирати убо плоть, преходит бо, прилежати же о души, вещи бессмертней. Темже и со ангелы срадуется, преподобне Моисее, дух твой.

Кондак, глас 4-й

Мурины заушив, и лица демонов поплевав, мысленно просиял еси, якоже солнце светло, светом жития твоего и учением наставляя души наша.

Молитва Моисею Мурину

О, великая сила покаяния! О, неизмеримая глубина милосердия Божия! Ты, преподобне Моисей, был прежде разбойником, но потом ужаснулся своих грехов, возскорбел о них, и в раскаянии пришел в монастырь, и там в великом плаче о своих бывших беззакониих и в трудных подвигах проводил дни свои до кончины, и удостоился Христовой благодати прощения и дара чудотворения. О, преподобне, ты от тяжких грехов достиг пречудных добродетелей! Помози и молящимся тебе рабом Божиим (имена), влекомым в погибель от того, что предаются безмерному, вредному для души и тела употреблению вина. Склони на них свой милостивый взор и не презри их, но внемли им, прибегающим к тебе. Моли, святе Моисей, Владыку Христа, чтобы не отверг их Он, Милосердный, и да не возрадуется диавол их погибели, но да пощадит Господь этих безсильных и несчастных (имена), которыми овладела пагубная страсть пьянства, ведь мы все Божии создания и искуплены Пречистой Кровию Сына Его. Услышь же, преподобный Моисей, их молитву, отгони от них диавола, даруй им силу победить их страсть, помоги им, простри твою руку, выведи их на путь добра, освободи от рабства страстей и избавь от их от винопития, чтобы они, обновленные, в трезвении и светлом уме, возлюбили воздержание и благочестие, вечно прославляли Всеблагого Бога, всегда спасающего Свои создания. Аминь.

К списку молитв

Тексты молитв св. Вонифатию

В Русской Православной церкви мученика Вонифатия почитают молитвами, акафистом и каноном. Для избавления человека от алкогольной зависимости принято читать специальные молитвы и акафист. Благодарят святого пением тропарей и кондаков в дни памяти.

От пьянства и алкоголизма

О, всесвятый Вонифатие, милостивый раб Милосердаго Владыки! Услыши прибегающих к тебе, одержимых пагубным пристрастием к винопитию, и, как в своей земной жизни ты никогда не отказывал в помощи просящим тя, так и теперь избави этих несчастных (имена). Некогда, богомудрый отец, град побил твой виноградник, ты же, воздав благодарение Богу, велел немногие сохранившиеся грозды положйти в точиле и позвати нищих. Затем, взяв новое вино, ты разлил его по каплям во все сосуды, бывшие в епископии, и Бог, исполняющий молитву милостивых, совершил преславное чудо: вино в точиле умножилось, и нищие наполнили свои сосуды. О, святителю Божий! Как по твоей молитве умножилось вино для нужд церкви и для пользы убогих, так ты, блаженный, уменьши его теперь там, где оно приносит вред, избави от пристрастия к нему предающихся постыдной страсти винопития (имена), исцели их от тяжкого недуга, освободи от бесовского искушения, утверди их, слабых, дай им, немощным, крепость и силу благоу спешно перенести это искушение, возврати их к здоровой и трезвой жизни, направи их на путь труда, вложи в них стремление к трезвости и духовной бодрости. Помоги им, угодник Божий Вонифатие, когда жажда вина станет жечь их гортань, уничтожи их пагубное желание, освежи их уста небесною прохладою, просвети их очи, постави их ноги на скале веры и надежды, чтобы, оставив свое душевредное пристрастие, влекущее за собой отлучение от Небеснаго Царствия, они, утвердившися в благочестии, удостоились непостыдной мирной кончины и в вечном свете бесконечного Царства Славы достойно прославляли Господа нашего Иисуса Христа со Безначальным Его Отцем и с Пресвятым и Животворящим Его Духом во веки веков. Аминь.

Короткая

После прочтения короткой молитвы можно своими словами обратиться к мученику Вонифатию и попросить о помощи.

«Спаси, Господи, и помилуй рабов Твоих (имярек ) словесами Божественного Евангелия Твоего, читаемыми о спасении рабов Твоих сих (имярек ). Попали, Господи, терние всех согрешений их, вольных и невольных, и да вселится в них благодать Твоя, просвещающая, опаляющая, очищающая всего человека. Во имя Отца и Сына и Святаго Духа. Аминь».

Тропарь и кондак

Тропарь, глас 4-й

Правило веры и образ кротости, воздержания учителя яви тя стаду твоему яже вещей истина: сего ради стяжал еси смирения высокая, нищетою богатая. Отче священноначальниче Вонифатиe, моли Христа Бога спастися душам нашим.

Кондак, глас 2-й

Божественный гром, труба духовная, веры насадителю и отсекателю ересей, Троицы угодниче, великий святителю Вонифатиe, со ангелы предстоя присно, моли непрестанно о всех нас.

Пресвятой Богородице и Приснодеве Марии пред Ее иконой «Неупиваемая Чаша»

Тропарь, глас 4-й

Днесь притецем вернии к Божественному и пречудному образу Пресвятыя Богоматери, напaяющей верных сердца небесною Неупиваемою Чашею Своего милосердия, и людем верным чудеса показующей. Яже мы видяще и слышаще духовно празднуем и тепле вопием: Владычице Премилостивая, исцели наша недуги и страсти, молящи Сына Твоего, Христа Бога нашего, спасти души наша.

Кондак

Избранное и дивное избавление нам даровася — Твой образ честный, Владычице Богородице, яко избавльшеся явлением его от недугов душевных и телесных и скорбных обстояний, благодарственная хваления приносим Ти, Всемилостивая Заступнице. Ты же, Владычице, Неупиваемою Чашею нами именуемая, приклонися благоутробно к нашим воздыханиям и воплем сердечным, и избавление подаждь страждущим недугом пианства, да с верою воззовем Ти: Радуйся, Владычице, Неупиваемая Чаше, духовную жажду нашу утоляющая.

Молитва перед иконой Божией Матери «Неупиваемая Чаша»

О, Премилосердая Владычице! К Твоему заступлению ныне прибегаем, молений наших не презри, но милостивно услыши нас: жен, детей, матерей и тяжким недугом пианства одержимых, и того ради от матере своея — Церкви Христовой и спасения отпадающих, братьев и сестер, и сродник наших исцели. О, Милостивая Мати Божия, коснися сердец их и скоро возстави от падений греховных, ко спасительному воздержанию приведи их. Умоли Сына Своего, Христа Бога нашего, да простит нам согрешения наша и не отвратит милости Своея от людей Своих, но да укрепит нас в трезвении и целомудрии. Приими, Пресвятая Богородице, молитвы матерей, о чадех своих слезы проливающих, жен, о мужех своих рыдающих, чад, сирых и убогих, заблудшими оставленных, и всех нас, к иконе Твоей припадающих. И да приидет сей вопль наш, молитвами Твоими, ко Престолу Всевышняго. Покрый и соблюди нас от лукаваго ловления и всех козней вражиих, в страшный же час исхода нашего помоги пройти непреткновенно воздушныя мытарства, молитвами Твоими избави нас вечнаго осуждения, да покрыет нас милость Божия в нескончаемые веки веков. Аминь.

Повторное исследование биологии черепных швов мышей: микрокомпьютерная томография в сравнении с гистологическим методом

Задний план: Гистология остается стандартной формой анализа черепного шва на мышиных моделях, но этот метод дает лишь ограниченные «моментальные снимки» всего шва и требует эвтаназии животных с разрушением тканей. Из-за микроархитектуры костного комплекса требуются более совершенные методы для изучения поведения черепного шва и окружающей его среды. Авторы сравнили микрокомпьютерную томографию и гистологию как методы оценки черепных швов мышей.

Методы: Всего было обработано 360 изображений микрокомпьютерной томографии и от 160 до 170 гистологических срезов мышей на 22-й и 45-й день после рождения соответственно. После эвтаназии задние лобные и сагиттальные швы были визуализированы с помощью системы микрокомпьютерной томографии и впоследствии обработаны для гистологического анализа.Количественный анализ двумерных изображений был выполнен для определения процентного содержания кости в образце толщиной 1 мм.

Результаты: Количественный анализ процентного содержания кости в швах показал идентичные закономерности с помощью методов микрокомпьютерной томографии и гистологии. Оба метода продемонстрировали, что задний лобный шов имеет более тяжелые паттерны сращения в передней и эндокраниальной частях, с различными участками пропусков полной проходимости на эндокраниальной поверхности, эктокраниальной поверхности или на обеих на 45-й день.

Выводы: Слияние черепных швов в мышиной модели не является феноменом «все или ничего». Задний лобный шов, ранее считавшийся полностью сращенным на 45-й день по данным гистологического анализа, показал различное слияние по длине шва при использовании обоих методов. Количественная оценка доли кости в заднем лобном и сагиттальном швах, а также морфологическая оценка этих швов продемонстрировали сходные результаты обоих методов.В то время как тщательная гистологическая оценка всего шва была бы чрезвычайно трудоемкой и непрактичной, эти результаты помогают утвердить микрокомпьютерную томографию как быстрый и надежный метод исследования всего шва на мышиных моделях.

Двухфазное сращение заднего лобного шва у мышей

Задний план: Краниосиностоз – это преждевременное сращение черепных швов на ранних стадиях развития. Мышей обычно используют для изучения механизмов, управляющих как нормальным, так и патологическим развитием черепных швов. Несмотря на их частоту использования в качестве модели, временной ход формирования и минерализации кости во время слияния заднего лобного шва у мышей четко не определен.

Методы: Чтобы решить эту проблему, мышей C57Bl/6J подвергали эвтаназии в возрасте от 6 до 107 дней, а задние лобные швы визуализировали с помощью микрокомпьютерной томографии.Сканы были проанализированы с помощью алгоритма обработки изображений, который ранее был проверен с помощью серийной гистологии для количественной оценки как сращения швов, так и содержания минералов. Профиль экспрессии генов, связанных с ключевыми временными точками развития, исследовали с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени как в кости, так и в твердой мозговой оболочке.

Результаты: Результаты показывают, что кости заднего лобного шва сближаются в течение 10–20 дней, а затем увеличиваются в минеральном составе и в объеме между 21 и 45 днями.Начало сращения заднего лобного шва было связано с увеличением генов, связанных с хрящом, на 12-й день. Более поздняя минерализация шва была связана с увеличением мРНК маркеров дифференцировки остеобластов, костных морфогенетических белков и ингибиторов костных морфогенетических белков.

Выводы: Полный анализ заращения заднего лобного шва показывает, что оно происходит по прерывистому двухфазному типу.Первая фаза длится от 10 до 20 дней и включает в себя производство хряща. Вторая фаза минерализации с 21-го по 45-й день наблюдалась как с помощью алгоритма визуализации, так и с изменениями в экспрессии генов.

Анализ одиночных клеток определяет ключевую роль Hhip в развитии венечного шва у мышей

Анализ РНК-секвенций отдельных клеток определяет структуру популяции венечного шва дикого типа мышь на поздних стадиях эмбрионального развития, E16.5–E18.5. На E16.5 перекрытие лобных и теменных костей находится на ранней стадии и полностью устанавливается на E18.5, в последний день мышиного эмбриогенеза в штамме C57BL/6 J, использованном в этом исследовании. Чтобы идентифицировать клеточные популяции, присутствующие в этот переходный период, мы проанализировали развитие коронарного шва WT с помощью анализа одноклеточной РНК-секвенции (scRNA-seq) четырех библиотек, состоящих из двух повторов на E16.5 и E18.5. Библиотеки были получены из полос венечных швов, охватывающих перекрывающиеся лобные и теменные кости, включая OFs каждой кости и промежуточный SM (дополнительный рис.1а). Внешовные ткани были удалены настолько, насколько это было возможно для обогащения шовной популяции.

Анализируя вместе все четыре библиотеки, мы идентифицировали 14 клеточных популяций (дополнительный рисунок 1b, d) со ссылкой на опубликованные атласы типов клеток ^{15,16,17,18,19} и наше ранее опубликованное исследование лобного шва мыши ¹³ . Эти популяции в целом соответствовали недавнему анализу коронарного шва мышей на E15.5 и E17.5 ²⁰ и включали популяции SM и остеобластов, а также гемопоэтические линии, сосудистые клетки и хондроциты.Большинство клеток были частью суперкластера, который включал популяции, специфичные для швов (например, SM, остеобласты; обозначенные как «CS» для « c oronal s uture» на дополнительном рисунке 1b), и составляли 56% и 86 % клеток на E16.5 и E18.5 соответственно (дополнительный рисунок 1b, c). Гематопоэтические, сосудистые и хондроцитарные популяции были общими для обоих возрастов. Хондроциты, предположительно, происходят из париетального хряща (tectum transversum), присутствующего в основании венечного шва ²¹ .

Определение и картирование клеточных популяций на E16.5

Для дальнейшего определения состава суперкластера мы провели дополнительный анализ UMAP ассоциированных клеток на каждой стадии развития. На E16.5 суперкластер, специфичный для швов, состоял из семи отдельных популяций, экспрессирующих известные маркеры для двух потенциальных популяций мезенхимы, остеобластов, гиподермы и твердой мозговой оболочки ^{13,16,17,18,19} (рис. 1a). Чтобы определить пространственные отношения этих популяций, мы использовали мультиплексную одномолекулярную флуоресцентную гибридизацию in situ (smFISH) для генов в пределах десяти наиболее значимых маркерных генов каждой популяции (рис.1b, дополнительный рисунок 2d и дополнительный набор данных 1). Маркерные гены определяли по их относительной специфичности для данной популяции по сравнению со всеми другими популяциями. Кроме того, мы выбрали маркерные гены с более высокой экспрессией для картирования, чтобы облегчить обнаружение. Две популяции включали мезенхиму в шве, CS6-4 ( c оральный s шейный E1 6 ,5 популяция 4 ) и CS6-6. CS6-4 состоял из SM между лобными и теменными костями и простирался за пределы OFs и был обогащен экспрессией Sox6 и Erg (рис.1c и дополнительный рисунок 2a). Эта популяция также экспрессировала Hhip в качестве маркерного гена более низкого ранга. Однако Hhip был маркерным геном с высоким рейтингом для аналогичной популяции SM на E18.5, поэтому его экспрессия также была картирована на E16.5, чтобы обеспечить точку сравнения между двумя возрастами. CS6-6 состоял из эктокраниального или наружного слоя мезенхимы над лобными и теменными костями и был обогащен экспрессией Igfbp3 .

a График равномерного многообразия аппроксимации и проекции (UMAP) кластеров клеток, обнаруженных путем неконтролируемого графического кластеризации специфических для шва популяций (например, шовной мезенхимы, остеобластов) из двух повторов на E16. 5. b Средняя экспрессия пяти наиболее дифференциально экспрессируемых маркерных генов (в рамке), ранжированных по кратности изменения (FC) (FDR % 0,01, lnFC R 0,1) для специфичных для швов популяций. Гены, отобранные для smFISH в c , окрашены в соответствии с их принадлежностью к популяции. c Локализация популяций с помощью smFISH. Каждая псевдоцветная панель показывает отдельный участок, гибридизованный с зондами для указанных генов. Схема обобщает пространственное распределение популяций с цветовой кодировкой, как в smFISH. Пунктирными линиями обозначены лобная (f) и теменная (p) кости; белые горизонтальные линии указывают на остеоид. Разрезы в поперечной плоскости. smFISH был выполнен на трех независимых образцах с аналогичными результатами. Масштабная линейка, 50  мкм. d Значимые категории GO BP сигнатур выражений, характерных для популяции.Обогащение Gene Ontology выполнялось с помощью ранжированного запроса и аналитической коррекции множественного тестирования ( p  ≤ 0,05, справа от пунктирной линии).

Три популяции включали ОФ и остеобласты. Первый состоял из пролиферирующих клеток на переднем крае лобной и теменной костей и был обогащен экспрессией Top2a (CS6-5; рис. 1c и дополнительный рис. 2a). Вторая состояла из основной популяции лобных и теменных костей и была обогащена экспрессией Ibsp , раннего маркера остеобластов (CS6-1).Третий состоял из меньшей популяции остеобластов, в основном обнаруженных на эндокраниальной или внутренней поверхности лобной кости, обогащенных экспрессией Mmp13 (CS6-3). Это не была специфичная для лобной кости популяция швов, так как Mmp13 также экспрессировался вне шва в более зрелых областях лобных костей, где высокая экспрессия Mmp13 и Ibsp обратно коррелировала с трабекулярной костью (дополнительная рис. 2б). Кроме того, в областях более зрелой теменной кости, удаленных от шва, Mmp13 экспрессировался на эндокраниальной поверхности, тогда как Ibsp экспрессировался на эктокраниальной поверхности (дополнительный рис. 2б). Две другие популяции были внешними по отношению к шву. Гиподерма была поверхностной по отношению к эктокраниальной мезенхиме и была обогащена экспрессией Clec3b (CS6-7). Твердая мозговая оболочка располагалась эндокраниально по отношению к шву и была обогащена экспрессией Fxyd5 (CS6-2). Популяции одиночных клеток E16.5 обобщены в дополнительной таблице 1.

Чтобы охарактеризовать программы транскрипции, характерные для отдельных популяций, мы провели анализ онтологии генов (GO) маркерных генов, отличающих каждую популяцию (рис.1d и дополнительный набор данных 1). Основная популяция SM (CS6-4) была обогащена морфогенезом анатомической структуры и развитием скелетной системы и тканей. Эктокраниальная мезенхима (CS6-6) была обогащена для регуляции клеточной коммуникации, передачи сигналов и положительной регуляции сигнального пути рецептора инсулиноподобного фактора роста. Пролиферирующая популяция OF (CS6-5) была обогащена клеточным циклом и связанными с ним процессами. Основная популяция остеобластов (CS6-1) была обогащена окостенением, организацией коллагеновых фибрилл, гликозилированием и гидроксилированием белков.Популяция малых остеобластов, экспрессирующая Mmp13 (CS6-3), была обогащена морфогенезом анатомической структуры, биологической адгезией и катаболизмом коллагена.

Определение и картирование клеточных популяций на E18.5

На E18.5 специфичный для швов суперкластер состоял из девяти отдельных популяций (рис. 2a). Мы определили пространственные отношения этих популяций, используя smFISH для важных маркерных генов (рис. 2b, дополнительный рисунок 3b и дополнительный набор данных 1).Три популяции включали мезенхиму внутри шва. Один состоял из мезенхимы между перекрывающимися лобными и теменными костями и был обогащен экспрессией Hhip и Cd34 (CS8-2; рис. 2c и дополнительный рис. 3a). Второй состоял из мезенхимы, прилегающей к OFs и области перекрытия между костями, и был обогащен экспрессией Mest (CS8-4), которая также перекрывала домен экспрессии Hhip . Третий состоял из эктокраниального слоя мезенхимы над лобными и теменными костями и был обогащен экспрессией Col8a1 (CS8-7).

график UMAP кластеров клеток, обнаруженных с помощью неконтролируемой графической кластеризации специфичных для швов популяций (т. е. шовной мезенхимы, остеобластов) из двух повторов на E18.5. b Средняя экспрессия пяти наиболее дифференциально экспрессируемых маркерных генов (в рамке), ранжированных по FC (FDR % 0,01, lnFC R 0,1) для специфических для швов популяций. Гены, отобранные для smFISH в c , окрашены в соответствии с их принадлежностью к популяции.Для CS8-6 использовали Cxcl12 , который входит в первую десятку маркеров этой популяции, для его известной экспрессии в твердой мозговой оболочке ¹³ . c Локализация популяций с помощью smFISH. Каждая псевдоцветная панель показывает отдельный участок, гибридизованный с зондами для указанных генов. Схема обобщает пространственное распределение популяций с цветовой кодировкой, как в smFISH. Пунктирными линиями обозначены лобная (f) и теменная (p) кости; белые горизонтальные линии указывают на остеоид.Разрезы в поперечной плоскости. smFISH был выполнен на трех независимых образцах с аналогичными результатами. Масштабная линейка, 50  мкм. d Значимые категории GO BP сигнатур выражений, характерных для популяции. Обогащение Gene Ontology выполнялось с помощью ранжированного запроса и аналитической коррекции множественного тестирования ( p  ≤ 0,05, справа от пунктирной линии).

Пять популяций состояли из ОФ и дифференцированных остеобластов. Первый состоял из пролиферирующих клеток на переднем крае лобной и теменной костей и был обогащен экспрессией Top2a (CS8-1; рис.2c и дополнительный рисунок 3a). Второй располагался вдоль периостальных поверхностей, особенно в области лобного и теменного перекрытия, и был обогащен экспрессией Col6a3 и Postn (CS8-3). Экспрессия Col6a3 оказалась более сильной, чем Postn по отношению к OF. Эта популяция также была обогащена экспрессией Fgfr2 , который, как известно, экспрессируется в OF и надкостничных поверхностях лобных и теменных костей ^22,23,24 (дополнительный набор данных 1).Третий состоял из остеобластов, отходящих от ОФ вдоль остеоида лобной и теменной костей, и был обогащен экспрессией Ibsp (CS8-9). Четвертый простирался от шва вдоль кости дистально до остеобластов, экспрессирующих Ibsp , и был обогащен экспрессией Spp1 , маркера более зрелых остеобластов (CS8-8). Пятый в основном простирался вдоль эндокраниальной поверхности лобной кости и был обогащен экспрессией Mmp13 (CS8-5).Конечная популяция включала твердую мозговую оболочку эндокраниальнее шва и была обогащена экспрессией Cxcl12 (CS8-6). Популяции одноклеточных клеток E18.5 обобщены в дополнительной таблице 1.

Мы дополнительно изучили взаимосвязь пролиферирующей популяции CS8-1 с соседними CS8-2 и CS8-3, а также с другими популяциями. В то время как все другие популяции содержали клетки, экспрессирующие маркеры пролиферации, такие как Mki67 , с низкой частотой, CS8-1 в первую очередь отличалась широкой экспрессией генов, связанных с пролиферацией (рис.2б и дополнительный рис. 4а). CS8-1 имеет общую экспрессию подмножества генов с CS8-2 и CS8-3, которая отличает их от остальных популяций швов, что позволяет предположить, что она может представлять собой переходную популяцию между популяцией SM CS8-2 и надкостничной популяцией CS8-3. Дополнительный рис. 4b). CS8-1 также экспрессирует гены, не связанные с пролиферацией, что отличает его как от CS8-2, так и от CS8-3, что дополнительно указывает на то, что это отдельная популяция.

Мы провели GO-анализ маркерных генов, отличающих каждую популяцию, идентифицированную с помощью анализа дифференциальной экспрессии (рис.2d и дополнительный набор данных 1). Для популяций SM Hhip -экспрессирующий SM (CS8-2) был обогащен организацией внеклеточной структуры, клеточной адгезией, дифференцировкой клеток и развитием скелетной системы. Mest , экспрессирующий SM (CS8-4), был обогащен отрицательной регуляцией сигнального пути трансмембранного рецепторного белка серин/треонинкиназы и отрицательной регуляцией клеточного ответа на стимул фактора роста. Эктокраниальная мезенхима (CS8-7) была обогащена клеточными коммуникациями, передачей сигналов между клетками и миграцией клеток.

Для популяций OF и остеобластов термины GO подтвердили их различные роли в развитии скелета. Пролиферирующая популяция (CS8-1) была обогащена клеточным циклом и связанными с ним процессами. Периостальная популяция (CS8-3) была обогащена процессами биосинтеза стеролов, холестерина и изопреноидов. Популяция остеобластов, экспрессирующих Ibsp (CS8-9), была обогащена организацией внеклеточного матрикса и положительной регуляцией клеточной пролиферации. Популяцию остеобластов, экспрессирующих Spp1 (CS8-8), обогащали для развития биоминеральной ткани.Популяция остеобластов, экспрессирующих Mmp13 (CS8-5), была обогащена для развития тканей и процесса метаболизма коллагена.

Сложность популяции в коронарном шве увеличивается между E16.5 и E18.5

Мы сопоставили клеточные популяции на E16.5 с популяциями на E18.5 на основе значительного перекрытия сигнатур экспрессии (дополнительный рисунок 3c и дополнительная таблица 1) . Большинство популяций SM и связанных с остеобластами были явно сходны между E16.5 и E18.5, включая основные популяции SM, экспрессирующие Hhip (CS6-4 и CS8-2), эктокраниальные популяции SM (CS6-6 и CS8-7). ), Top2a — экспрессирующие пролиферирующие популяции (CS6-5 и CS8-1), Mmp13 — экспрессирующие остеобласты (CS6-3 и CS8-5) и популяции твердой мозговой оболочки (CS6-2 и CS8-6).Остеобласты, экспрессирующие Ibsp , на E16.5 (CS6-1) соответствовали как остеобластам, экспрессирующим Ibsp (CS8-9), так и более дифференцированным остеобластам, экспрессирующим Spp1 (CS8-8), на E18.5. Мы не идентифицировали дискретные популяции Mest -экспрессирующих SM-клеток (CS8-4) или Col6a3 -экспрессирующих периостальных клеток (CS8-3) на E16. 5, но Mest и Col6a3 экспрессируются на E16. 5 в тех же доменах, что и на E18.5 (дополнительный рисунок 2c), и были маркерными генами для CS6-4 и CS6-3 соответственно.Эти различия могут отражать изменения количества клеток в каждой из этих популяций или отсутствие достаточной специфичности экспрессии маркерных генов в этом возрасте. Clec3b -экспрессирующая гиподерма (CS6-7) не была идентифицирована на E18.5. Вероятно, это было связано с более легким и эффективным удалением внешовной ткани, такой как гиподерма, на E18.5 по сравнению с E16.5.

Эктокраниальные, периостальные и остеобластные популяции обогащены генами краниосиностоза

Было идентифицировано около 57 генов, которые вызывают коронарный краниосиностоз при мутации у людей ^5,7 (дополнительный набор данных 2).Мы определили степень обогащения этими генами среди клеточных популяций в каждом возрасте. При E16.5 значительные обогащения были обнаружены в экскокрановой мезенхиме (CS6-6; CYP26B1 , IGF1R , LMX1B , stat3 , Twist1 , zic1 ; p = 0,013) и MMP13 — экспрессирующие остеобласты (CS6-3; ALPL , ATR , FGFR2 , FGFR3 , KAT6A , KAT6A ; kmt2d ; p = 0. 006). UMAP, подчеркивающие паттерны экспрессии для каждого из этих генов, показаны на дополнительном рисунке 5a. На E18.5 значительные обогащения были обнаружены в эктокрановой мезенхиме (CS8-7; ABCC9 , CYP26B1 , FBN1 900B1 GPC3 , IGF1R , Stat3 , Twist1 , zic1 ; P  = 0,007), остеобласты, экспрессирующие Mmp13 (CS8-5; Alpl , Fgfr3 ; P  = 0.044) и надкостничной популяции (CS8-3; Fgfr2 , Flna , P4hb ; P  = 0,029). Если бы мы использовали 96 генов, в настоящее время связанных с краниосиностозом любого шва ^5,7 , эти пять популяций также значительно обогатились. Кроме того, IBSP -эфирное население остеобласта в E18.5 было значительно обогащено (CS8-9; B3GAT3 , BMP2 , FAM20C , IHHH , IRX5 , PHEX , Sec24d , Sh4pxd2b ; P  = 0.001). UMAP, подчеркивающие паттерны экспрессии каждого из этих генов краниосиностоза человека, показаны на дополнительном рисунке 5b.

Мы повторили анализ обогащения для 23 генов, которые вызывают корональный краниосиностоз при мутации у мышей, 11 из которых являются моделями заболеваний человека ^25,26 (дополнительный набор данных 2). На E16.5 значительное обогащение было обнаружено в эктокраниальной мезенхиме (CS6-6; Axin2, Fgf9, Lmx1b, Twist1 ; P  = 0,001) и остеобластах, экспрессирующих Mmp13 (CS6-3; Alpl , Fgfr3; P  = 0.005 ) . На E18.5 значительное обогащение было обнаружено в остеобластах, экспрессирующих Mmp13 (CS8-5; Alpl , Fgfr3, Runx2 ; P  = 0,0002). Если бы мы использовали 31 ген, связанный с краниосиностозом любого шва у мышей ^25,26 , только популяции остеобластов, экспрессирующих Mmp13 , были значительно обогащены. Эти две популяции были общими для человеческого анализа, но наше обнаружение меньшего количества популяций, обогащенных мышиными генами краниосиностоза, по сравнению с человеческими, может быть связано с меньшим количеством мышиных генов, доступных для анализа. В целом, эти профили обогащения предполагают, что гены, вызывающие краниосиностоз, функционируют в различных популяциях шовных клеток и, таким образом, посредством различных механизмов.

Экспрессия Hhip отличает мезенхиму коронарного шва от других швов свода черепа

Поскольку молекулярные процессы и клеточный состав СМ плохо охарактеризованы по сравнению с дифференцировкой остеобластов, мы сосредоточились на выявлении уникальных особенностей популяций коронарных СМ.Венечный шов морфологически отличается от других швов свода черепа тем, что кости перекрываются во время изученного эмбрионального периода, что может отражаться отчетливой транскрипционной подписью. Мы пересекли значимые маркерные гены из всех одноклеточных мезенхимальных популяций (CS6-4, CS6-6, CS8-2, CS8-4 и CS8-7; дополнительный набор данных 1) с нашими массовыми наборами данных секвенирования РНК свода черепа. швы (венечный, лобный, сагиттальный и ламбдовидный швы) ^27,28 . Эти объемные наборы данных содержат профили экспрессии генов SM и OF для каждой нити, что позволяет идентифицировать дифференциальную экспрессию генов между SM и OF.Это пересечение данных одноклеточных и массовых РНК-секвенций ранжировало одноклеточные мезенхимальные маркерные гены по степени, в которой их средняя экспрессия была обогащена коронарной СМ по сравнению с другими швами (рис. 3а). Hhip , маркер CS6-4 и CS8-2, был уникален тем, что он был обогащен только SM коронарного шва, тогда как он был обогащен OF других швов свода черепа (рис. 3a). Напротив, другие мезенхимальные гены обычно были обогащены СМ всех или большинства швов свода черепа и, следовательно, не были транскрипционно отличными маркерами коронарной СМ.Мы повторили этот анализ с совокупным списком объединенных десяти лучших маркерных генов основных популяций SM, CS6-4 и CS8-2. Hhip был геном, наиболее значительно обогащенным коронарным SM (рис. 3b). Напротив, другие гены, такие как Angptl2 , Adamts8 , Cd34 , Erg , Ets2 и Itgb5 , были обогащены SM всех швов свода черепа (рис. 3). Hhip является компонентом пути HH. Для дальнейшего изучения этого пути мы провели аналогичное сравнение между списком ключевых членов пути HH и общей экспрессией генов SM и OF во всех швах свода черепа.Экспрессия лиганда Indian hedgehog ( Ihh ), его рецепторов Ptch2 и Ptch3 , а также мишени транскрипции HH Gli1 была повышена в остеогенных фронтах всех швов свода черепа (рис. 3c). В соответствии с этим выводом, Ihh был обогащен популяциями одноклеточных остеобластов CS6-1 и CS8-9 (дополнительный набор данных 1).

Рис. 3: Обогащение экспрессии Hhip в SM специфично для коронарного шва.

a Средние объемные изменения экспрессии значимых маркерных генов (рядов) всех популяций SM по четырем швам свода черепа.Изменения экспрессии показаны как log2FC между SM и остеогенными фронтами (OF) на E16.5 и E18.5, ранжированные по их «показателю корональной специфичности» (CS), представляющему разницу между средней экспрессией по данным коронарного шва и средняя выраженность остальных швов (ламбдовидного, сагиттального и лобного). Лобная ОВ (ФР), теменная ОВ (ПА), межтеменная ОВ (ИП). b Средние объемные изменения экспрессии генов комбинированных десяти лучших маркерных генов популяций SM CS6-4 и CS8-2 по четырем швам свода черепа.Изменения выражения показаны как в a . c Средние объемные изменения экспрессии генов ключевых генов пути hedgehog в четырех швах свода черепа. Изменения выражения показаны как в a .

Популяция, экспрессирующая

Hhip , сохраняется постнатально и способствует росту костей свода черепа. Сначала мы определили потенциальные взаимодействия лиганд/рецептор между популяциями по экспрессии их генов, используя CellPhoneDB ²⁹ на E18.5, когда было определено больше клеточных популяций (дополнительный рис. 6). Hhip , экспрессирующий CS8-2, имел наиболее потенциальное взаимодействие с твердой мозговой оболочкой (CS8-6), эктокраниальной мезенхимой (CS8-7) и ранними остеобластами (CS8-9), но в целом CS8-2 показал меньше взаимодействий по сравнению с другими популяции (дополнительный рис. 6a). Твердая мозговая оболочка (CS8-6) и эктокраниальная мезенхима (CS8-7) имеют наибольшее количество потенциальных взаимодействий, но также представляют собой наиболее широко разделенные популяции. Однако у обоих было одинаковое количество потенциальных взаимодействий с популяциями мезенхимы (CS8-4) и остеобластов (CS8-9, CS8-8).Затем мы сосредоточились на потенциальных взаимодействиях лиганда и рецептора, особенно с участием генов, экспрессируемых в CS8-2 (дополнительная рис. 6b). Заметные потенциальные взаимодействия, особенно с популяциями, ближайшими к CS8-2, включали множество комплексов коллаген/интегрин и членов сигнальных путей FGF и TGF. Что касается передачи сигналов HH, IHH и HHIP показали заметное взаимодействие. Затем мы вывели приблизительную абстракцию графа на E18.5 (рис. 4a). График траектории CS8-2 состоял из двух основных ветвей.Одна ветвь проходит через CS8-5 и соединяется с пролиферирующим CS8-1, периостальными CS8-3 и остеобластическими CS8-8 и CS8-9. Другая ветвь простиралась через CS8-4, прежде чем разветвляться на эктокраниальную мезенхиму CS8-7 и твердую мозговую оболочку CS8-6. Оба этих анализа предполагают сложные взаимодействия между популяциями коронарных швов во время развития.

Рис. 4: Картирование судьбы Hhip -CreERT2-экспрессирующей шовной мезенхимы.

a Графическая абстракция отношений между CS8-1 и CS8-9.Врезка показывает раскраску по идентификатору кластера. Корневое состояние предполагаемой траектории обозначается цифрой 1 в центре ячеек с самым ранним псевдовременем. b TdTomato-экспрессирующие (tdTomato + ) клетки на постнатальный день (P)2 после 1 дня индукции. n  = 3. c Клетки TdTomato+ на P3 после двух последовательных дней индукции. n  = 3. d Клетки TdTomato+ на P6 после пяти последовательных дней индукции. n  = 1, e Клетки TdTomato+ на P30 после 1-го дня индукции на P1.Пунктирная рамка увеличена справа, чтобы показать кластер остеобластов tdTomato+ в домене ALPL (пунктирные линии). n  = 1. f Клетки TdTomato+ на P90 после двух последовательных дней индукции на P1 и P2. n  = 3, г клеток TdTomato+ на P90 после пяти последовательных дней индукции между P1-P5. n  =  2. Белые и желтые пустые/закрашенные стрелки указывают на остеобласты/остеоциты tdTomato+ в теменной и лобной костях соответственно. f лобная кость, p теменная кость.Разрезы в сагиттальной плоскости. Масштабные линейки, 100 мкм, кроме вставки в и , 50 мкм.

Чтобы выяснить связь между Hhip -экспрессирующими и другими популяциями коронарного шва in vivo, мы скрестили мышей Hhip -CreERT2 с репортерной линией Ai14 ³⁰ и индуцировали рекомбинацию у детенышей в раннем постнатальном периоде индукцией тамоксифеном. Ежедневная индукция тамоксифеном, начиная с P1 в течение одного, двух или пяти дней, показала, что активность Hhip -CreERT2 была дозозависимой и высокоспецифичной для SM (рис.4б-г). Кроме того, после пяти дней индукции было незначительное мечение преостеобластов и остеобластов, экспрессирующих щелочную фосфатазу (ALPL), несмотря на широко распространенное мечение соседних SM, которые распространялись вокруг париетального OF в эктокраниальную мезенхиму. Эти данные свидетельствуют о том, что меченые клетки SM не дифференцировались быстро в остеобласты в раннем постнатальном периоде (рис. 4d). Через 30 дней после индукции на P1 частота меченых клеток в SM значительно увеличилась, но относительно небольшое количество клеток дифференцировалось в остеобласты (рис.4д). Через 90 дней после индукции на P1 и P2 меченые клетки все еще присутствовали в СМ, но теперь были включены в виде остеобластов и остеоцитов в лобные и теменные кости (рис. 4f). Точно так же через 90 дней после ежедневной индукции между P1 и P5 меченые клетки были широко распространены в СМ, остеобластах и ​​остеоцитах (рис. 4g).

Hhip необходим для нормального развития венечного шва

Мы пришли к выводу, что экспрессия Hhip в СМ необходима для нормального развития венечного шва, и потеря его функции может привести к дисгенезии шва.Таким образом, мы исследовали венечный шов у мышей Hhip ^-/- и обнаружили ранее не зарегистрированный дефект венечного шва. На E16.5 окрашивание активности ALPL показало, что перекрытие лобных и теменных костей, наблюдаемое в WT, было уменьшено или отсутствовало в мутантных швах, так что OFs располагались более близко друг к другу (рис. 5a). В шве WT RUNX2, маркер остеопредшественников и более дифференцированных остеобластов, экспрессировался в SM, OF и более дифференцированных остеобластах (рис.5b), в то время как SP7, маркер коммитированных преостеобластов, экспрессировался в OF и более дифференцированных остеобластах (рис. 5c). Экспрессия RUNX2 и SP7 в мутантных швах локализована в тех же шовных областях, что и у WT, несмотря на измененную морфологию костей (рис. 5b, c). Никакой разницы в пролиферации лобных или теменных OF или SM не наблюдалось между WT и мутантными швами (рис. 5d, e). Общее количество клеток в лобных и теменных ОФ было сходным между WT и мутантными швами, но наблюдалась тенденция к меньшему количеству клеток в мутантных SM (рис.5е). Мутантные OF казались более широкими, чем более конусообразные OF WT (рис. 5a–c). Для количественной оценки этого расширения измеряли площадь активности OF ALPL в пределах 50  мкм от края лобной и теменной костей. Мутантные фронты не показали разницы по сравнению с WT (1193 ± 184 мкМ ² , N = 3, по сравнению с 1282 ± 216 мкМ ² , N = 3, p = 0,62), но мутантные тематические Имел значительно большую площадь по сравнению с WT (1207 ± 45 мкМ ² , N = 3, по сравнению с 723 ± 8 мкМ ² , N = 3, P = 0.000054). Оценка апоптоза с помощью анализа TUNEL не обнаружила апоптотических клеток в WT или мутантных швах (рис. 5g).

Рис. 5: Дисгенезия венечного шва у мышей Hhip ^-/- на E16.5.

a Окрашивание на активность щелочной фосфатазы (ALPL, красный) в преостеобластах и ​​остеобластах для дикого типа (WT) и мутантных ( Hhip ^-/- ) коронарных швов. f лобная кость; р теменная кость, см шов мезенхимы. b Иммуногистохимия для RUNX2 (зеленый).Секции такие же, как показано в a . c Иммуногистохимия для SP7 (зеленый). d Пролиферация обнаружена путем включения EdU (зеленый). Срезы контрастно окрашены для активности ALPL (красный) и DAPI (синий). e Количественная оценка включения EdU в остеогенные фронты (OF) и шовную мезенхиму (SM). WT и Hhip ^−/− обозначены черным и красным соответственно. n  = 3 WT и три  Hhip ^−/− . f Количественное определение количества клеток на секцию в OFs и SM. n  = 3 WT и три Hhip ^−/− . г Анализ TUNEL на апоптотические клетки. Вставка: пример апоптотической клетки в нешовной ткани на том же предметном стекле. Белые пунктирные контуры, лобная и теменная кости. Данные e и f представлены в виде точечных диаграмм, показывающих среднее ± стандартное отклонение. Результаты, представленные в A , B , C , D , и г , и г представляют собой представителю N = 3 WT и три Емпина ^{— / —} Независимые образцы. Разрезы в поперечной плоскости. Масштабная линейка, 50  мкм. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.

На E18.5 аномальный фенотип Hhip ^-/- был более тяжелым. Коронарные швы по-прежнему имели небольшое перекрытие лобных и теменных костей по всей длине шва или отсутствовали, а в некоторых регионах экспрессия ALPL показала, что OFs были настолько близко прилегали друг к другу, что промежуточный SM был небольшим или отсутствовал (рис. 6a). Экспрессия RUNX2 в мутантных швах локализована в тех же шовных областях, что и у WT (рис.6б). Там, где мутантный фенотип был более выражен, экспрессия SP7 была ниже и менее отчетлива между OF и предполагаемым SM, чем в швах WT (рис. 6c). Тенденция к уменьшению пролиферации преостеобластов в мутантных OF по сравнению с WT наблюдалась, но достигла значимости только в лобных OF (рис. 6d, e). Общее количество клеток в мутантных лобных и теменных ОФ было значительно увеличено по сравнению с WT, в то время как в мутантном СМ наблюдалось значительное уменьшение количества клеток (рис. 6f). Увеличение количества мутантных клеток OF было связано с очевидным расширением мутантных OFs по сравнению с диким типом.Для количественной оценки этого расширения измеряли площадь активности OF ALPL в пределах 50  мкм от края лобной и теменной костей. Mutant Frontal OFS показал тенденцию большей площади по сравнению с WT (2053 ± 411 мкМ ² , N = 6, по сравнению с 1562 ± 381 мкМ ² , N = 6, P = 0,06), И мутантные териатры имели значительно большую площадь по сравнению с WT (1773 ± 281 мкМ ² , N = 6, по сравнению с 1231 ± 355 мкМ ² , N = 6, p = 0.02). Оценка апоптоза с помощью анализа TUNEL не обнаружила апоптотических клеток в WT или мутантных швах (рис. 6g). На P0 в наиболее сильно пораженных областях венечного шва можно было обнаружить узкую область клеток, выражающих активность ALPL, между лобной и теменной костями (дополнительная рис. 7). Однако неонатальная смертность мышей Hhip ^-/- из-за гипоплазии легких исключает наблюдение более поздних фенотипов ¹⁴ . Hhip явно был необходим для нормального развития коронарного шва.

Рис. 6: Дисгенезия венечного шва у мышей Hhip ^-/- на E18.5.

a Окрашивание на активность щелочной фосфатазы (ALPL, красный) в преостеобластах и ​​остеобластах для WT и Hhip ^-/- коронарных швов. f, лобная кость; р, теменная кость; см, шов мезенхимы. b Иммуногистохимия для RUNX2 (зеленый). Секции такие же, как показано в a . c Иммуногистохимия для SP7 (зеленый). d Пролиферация обнаружена путем включения EdU (зеленый). Срезы контрастно окрашены для активности ALPL (красный) и DAPI (синий). e Количественная оценка включения EdU в остеогенные фронты (OF) и шовную мезенхиму (SM). WT и Hhip ^−/− обозначены черным и красным соответственно. Звездочка указывает на значительную разницу с использованием двустороннего критерия Стьюдента t ( P  = 0,030). n  = 6 WT и шесть Hhip ^−/− . f Количественное определение количества клеток на секцию в OFs и SM. Звездочка указывает на значительную разницу с использованием двустороннего критерия Стьюдента t ( P  = 0,018, 0,008 и 0,00004 соответственно). n  = 6 WT и шесть Hhip ^−/− . г Анализ TUNEL на апоптотические клетки. Вставка: пример апоптотической клетки в нешовной ткани на том же предметном стекле. Белые пунктирные контуры, лобная и теменная кости. Данные e и f представлены в виде точечных диаграмм, показывающих среднее ± стандартное отклонение.Результаты, представленные в a , b , c и g , являются репрезентативными для n  = 3 WT и трех независимых образцов Hhip ^-/- . Разрезы в поперечной плоскости. Масштабная линейка, 100  мкм. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.

Морфологию свода черепа WT и Hhip ^-/- сравнивали на E18. 5 с помощью микрокомпьютерной томографии (микроКТ) с использованием трехмерных (3D) координат расположения 39 анатомических ориентиров (дополнительная таблица 2). ).Анализ основных компонентов показал, что WT и мутантный свод черепа разделены как по форме (размер и форма, рис. 7a), так и по форме (нормализованной по размеру, рис. 7b) в соответствии с генотипом. Фронты минерализации лобных и теменных костей в пределах всех WT и мутантных венечных швов были разделены и не сливались (рис. 7c).

Рис. 7: Результаты анализа главных компонентов (PCA) данных микрокомпьютерной томографии (микроКТ) изображений Hhip ^−/− голов на E18.5.

Диаграммы рассеяния результатов оценок PC1 и PC2, основанные на анализе PCA уникальных линейных расстояний между трехмерными ориентирами для формы a и формы b (с поправкой на влияние аллометрии) WT ( n  = 4 ) и Hhip ^−/− ( n  = 7) черепов. c Трехмерная реконструкция микроКТ-изображений, показывающая дорсальные проекции лобной (f) и теменной (p) костей WT и Hhip ^-/- свода черепа.На вставках показаны боковые виды всего черепа. Изображения являются репрезентативными n  = 4 черепа WT и семи Hhip ^-/- черепов. Масштабные линейки, 1 мм.

Картирование населения

Hhip ^-/- коронарные швы идентифицируют позиционные изменения в популяции остеобластов, экспрессирующих Mmp13

Для оценки изменений популяции клеток в Hhip маркеры на E16.5 и E18.5 (рис. 8 и дополнительные рисунки 8 и 9). Поскольку Hhip не экспрессируется у мышей Hhip ^-/- , мы использовали экспрессию Cd34 в качестве маркера CS8-2. В обоих возрастах большинство популяционных маркеров демонстрировали сходные относительные паттерны экспрессии по сравнению с WT (рис. 1c и 2c). Экспрессия Cd34 оставалась присутствующей между лобными и теменными OF на E18.5, но ее ограниченный домен четко отражал потерю перекрытия костей в мутантном венечном шве (рис.8 и дополнительные рис. 3а и 9). Наиболее заметное различие было в положении экспрессирующей Mmp13 популяции. В обоих возрастах клетки, экспрессирующие Mmp13 , были обнаружены ближе к париетальной OF Hhip ^-/- и присутствовали в SM, в отличие от WT (рис. 8 и дополнительные рисунки 8 и 9).

Рис. 8: Локализация популяций Hhip ^-/- коронарных швов с помощью smFISH.

Каждая псевдоокрашенная панель показывает отдельный участок, гибридизованный с зондами для указанных генов в каждом возрасте.Экспрессию маркера E18.5 CS8-2, Cd34 , можно сравнить с WT на дополнительном рисунке 3a. Схемы суммируют пространственное распределение популяций с цветовой кодировкой, как в smFISH. Белые стрелки указывают на новую экспрессию Mmp13 . Пунктирными линиями обозначены лобная (f) и теменная (p) кости; белые горизонтальные линии указывают на остеоид. Разрезы в поперечной плоскости. smFISH был выполнен на трех независимых образцах с аналогичными результатами. Масштабные линейки, 50  мкм.

Сигнализация Hedgehog изменена в

Hhip ^-/- венечные швы

Затем мы исследовали изменения в экспрессии нижестоящих компонентов пути HH.Мутантный локус Hhip содержит репортер LacZ, присутствующий в одной копии у мышей Hhip ^+/- и в двух копиях у мышей Hhip ^-/- 4 4 4 . Экспрессия этого репортера на E18.5 была непропорционально увеличена в гомозиготных по сравнению с гетерозиготными мутантными венечными швами и была более широко экспрессирована, что указывает на то, что передача сигналов HH в локусе Hhip была увеличена в Hhip ^-/- коронарных швах. (Инжир.9а). Затем мы оценили экспрессию Ptch2 и Gli1 . В швах WT на E16.5 экспрессия Ptch2 была самой высокой в ​​OF, но распространялась на соседнюю мезенхиму и SM на более низких уровнях (рис. 9b). Экспрессия Gli1 перекрывала экспрессию Ptch2 , но распространялась дальше в соседнюю мезенхиму и по всей СМ (рис. 9c). В швах WT на E18.5 экспрессия Ptch2 была сильно обогащена OF и отсутствовала в SM (рис. 9d). Экспрессия Gli1 была обогащена ОФ и распространилась на небольшое расстояние в окружающую мезенхиму (рис.9e), но отсутствовал в SM, где экспрессия Hhip была самой высокой (рис. 2c). В мутантных швах на E16.5 экспрессия Ptch2 и Gli1 была сходной с WT (рис. 9b, c). В мутантных швах на E18.5 уровни экспрессии Ptch2 и Gli1 заметно не изменились (рис. 9d, e), но их экспрессия теперь распространилась по всей СМ между близко расположенными ОВ.

Рис. 9: Измененная передача сигналов HH в венечном шве Hhip ^-/- .

a Окрашивание LacZ (синее) в WT, Hhip ^+/- и Hhip ^{-/- 8 9044 в корональной области. B — B — E Smish для B , D PTCH2 и C , E GLI1 в WT и HHIP — / — Coronal Sutures на B , c E16.5 и d , e E18.5. Штриховыми линиями обозначены лобная (е) и теменная (р) кости; см, шов мезенхимы. Разрезы в поперечной плоскости. Результаты, представленные в a , являются репрезентативными для n  = 2 WT, двух независимых образцов Hhip +/- и двух независимых образцов Hhip -/-} . Результаты, представленные в b – e , являются репрезентативными для n  = 3 WT и трех независимых выборок Hhip ^-/- . Масштабные линейки, 50  мкм.

В дополнение к пути HH формирование коронарного шва регулируется многими другими сигнальными путями. Путь FGF чаще всего поражается мутациями при синдромальном краниосиностозе, затрагивающем венечный шов. Мутации пути TGF также приводят к сращению коронарных швов ^7,8 . Передача сигналов IHH может также усиливать передачу сигналов BMP ³¹ . Чтобы определить, затронуты ли эти пути в коронарном шве Hhip ^-/- , мы провели иммуногистохимию для фосфопротеинов, указывающих на активацию пути.Не было обнаружено различий между уровнем или относительным расположением фосфо-ERK1/2 и фосфо-p38 (передача сигналов FGF), фосфо-SMAD2 (передача сигналов TGF) или фосфо-SMAD1/5/9 (передача сигналов BMP) между WT и Hhip. ^-/- коронарные швы на E18.5 (дополнительный рисунок 10).

Развивающийся коронарный шов мыши при разрешении одной клетки

Мезенхимальная гетерогенность, зафиксированная секвенированием РНК в одной клетке

Чтобы определить клеточный состав коронарного шва эмбриона, мы провели секвенирование одноклеточной РНК коронарных швов, выделенных из E15. Эмбрионы мышей 5 и E17.5. Вскрытие включало небольшое количество лобной и теменной кости после удаления кожи и головного мозга (рис. 1а). Мы отфильтровали с использованием Seurat 3 R-Package ²³ и получили 8279 клеток на E15.5 (медиана 2460 генов на клетку) и 8682 клетки на E17.5 (медиана 3200 генов на клетку) (рис. 1b). Мы идентифицировали 14 кластеров ячеек посредством неконтролируемой кластеризации графа двух объединенных наборов данных. Остеогенные и мезенхимальные типы клеток были идентифицированы на основе экспрессии маркеров широкой мезенхимы/фибробласта ( Col1a1 ) и остеобласта ( Sp7 ) (рис.1б, пунктирная линия; Дополнительный рис. 1а, б; Дополнительные данные 1). Идентичность кластеров за пределами остеогенного/мезенхимального подмножества была определена с использованием ранее описанных маркеров и включала хондроциты, миелоидные клетки, тучные клетки, лимфоциты, перициты, остеокласты, эндотелиальные клетки, нейроны и глию (рис. 1b, c). Все основные типы клеток в нашем анализе присутствовали на E15. 5 и E17.5 (дополнительный рисунок 2a). Хондроциты были особенно многочисленны на E15.5 (дополнительный рисунок 2b), что подчеркивает непосредственную близость E15.5 венечный шов хрящевого черепа. Миелоидные клетки были более многочисленными на E17.5, что согласуется с сообщениями об усилении миелоидной дифференцировки на поздних эмбриональных стадиях ²⁴ (дополнительная рис. 2b).

Рис. 1: Секвенирование РНК одиночных клеток венечного шва E15.5 и E17.5.

a Схема рассечения коронарных швов E15.5 и E17.5. Желтыми пунктирными линиями обозначены рассеченные области. b График единообразной аппроксимации и проекции коллектора (UMAP) интегрированного E15.5 (8279 ячеек) и E17.5 (8682 ячейки). Остеогенные и мезенхимальные типы клеток обведены пунктирными линиями. c Точечный график, изображающий выбранные маркеры (определенные скорректированным значением p = 0 из теста суммы рангов Уилкоксона с использованием FindAllMarkers в Seurat), обогащенные для каждого типа вспомогательных клеток за пределами остеогенной и мезенхимальной популяции. d UMAP-анализ рекластеризованного остеогенного и мезенхимального подмножества, описанный в (b), разрешает 14 кластеров. e Остеогенная и мезенхимальная субпопуляции, разделенные стадиями развития. f Графическое изображение пропорций кластеров из остеогенной/мезенхимальной подгруппы, представленное как соотношение между клетками E15.5 и E17.5 в каждом кластере. г Точечный график, показывающий маркеры, обогащенные для каждого кластера в пределах остеогенного/мезенхимального подмножества.

Для анализа типов остеогенных и мезенхимальных клеток, которые могут составлять и поддерживать коронковый шов, мы повторно кластеризовали остеогенно-мезенхимальную популяцию и получили 14 кластеров, присутствующих как на E15.5, так и на E17.5 (рис. 1г–е). Анализ обогащенных генов для каждого кластера позволил нам присвоить вероятные идентичности каждому типу клеток (рис. 1g, дополнительные данные 2), которые мы подтвердили с помощью гибридизации in situ, как описано ниже. Мы наблюдали один эктокраниальный кластер, сильно представленный на E15.5, и менингеальный кластер, чрезмерно представленный на E17.5. Остеогенные клетки также были более распространены в наборе данных E17.5, хотя неясно, отражает ли это истинные биологические различия по сравнению с разным захватом клеток между рассечениями (рис.1а, е).

Разнообразие слоев мозговых оболочек ниже венечного шва

Оболочки участвуют в развитии черепа и нижележащего мозга, которые они разделяют ¹² . Они включают твердую мозговую оболочку, паутинную мозговую оболочку и мягкую мозговую оболочку. Чтобы определить идентичность менингеальных тканей, включенных в наши вскрытия, мы использовали недавнее транскриптомное исследование мозговых оболочек мыши E14 в качестве руководства ²⁵ . Маркеры, связанные с мягкой мозговой оболочкой ( Ngfr , Lama1 , Rdh20 ), не были совместно обогащены ни в одном из наших кластеров, что согласуется с удалением мягкой мозговой оболочки вместе с мозгом во время диссекции (рис. 2а). Напротив, маркеры, обогащенные в пределах арахноидной массы ( ALDH2A2 , CLDN11 , и TBX18 ) были в изобилии MG4, и MATA Mater Mater ( GJA1 , FXYD5 и CRABP2 ) в MG3 и MG4 , и в меньшей степени MG1 и MG2 (рис. 2а).

Рис. 2. Различные типы менингеальных клеток разрешаются с помощью scRNA-seq.

a Точечный график, изображающий выбранные маркеры, ранее связанные с мягкой мозговой оболочкой, паутинной оболочкой и твердой мозговой оболочкой. b Характерные участки генов, подтвержденные экспериментами in situ. c – f Комбинаторный анализ коронарных швов на месте для указанных маркеров на E15.5. Sp7 маркирует лобную (F) и теменную (P) кости, за исключением вставок (обведенных рамками) ниже. c Crabp2 и Gjb6 . Стрела, Crabp2 ⁺ / Gjb6 ⁺ ; наконечник стрелы, Crabp2 ⁺ . d Crabp2 и Nppc . Стрела, Crabp2 ⁺ / Nppc ⁺ ; наконечник стрелы, Nppc ⁺ . e Matn4 и Crabp2 . Стрелка, Матн4 ⁺ ; наконечник стрелы, Crabp2 ⁺ . f Matn4 и Nppc . Стрелка, Матн4 ⁺ /Nppc ⁺ ; наконечник стрелы, Nppc ⁺ ; двойные стрелки, Matn4 ⁺ . г Модель, обобщающая паттерны экспрессии генов менингеальных слоев, полученные в результате анализа отдельных клеток. Б, Мозг. In situ проводили в трех биологических повторах. Масштабная линейка = 50  мкм; верхние панели ( c – f ) имеют одинаковое увеличение.

Чтобы определить идентичность MG4, мы провели эксперименты in situ для высокоспецифичного маркера MG4, Gjb6 , в сочетании с маркером паутинной оболочки / твердой мозговой оболочки, Crabp2 (рис. 2b). Crabp2 и Gjb6 перекрываются под костью с Crabp2 одиночными положительными клетками (MG3), обнаруженными над доменом Crabp2 ⁺ / Gjb6 ⁺ (рис. 2с). Иммунофлуоресценция Crabp2 и Gja1 на E17.5 подтвердила, что эти маркеры паутинной оболочки / твердой мозговой оболочки исключены из мягкой мозговой оболочки (дополнительная рис. 3a). Перициты Rgs5 + были перемежены с клетками Gjb6 + в паутинном слое MG4, что согласуется с заметной сосудистой сетью, простирающейся от границы твердой мозговой оболочки и через паутинную мозговую оболочку к мягкой мозговой оболочке ²⁶ (дополнительный рисунок 3c) . В CRABP2 CRABP2 ⁺ / GJB6 ^— слой (MG3), мы также наблюдали сосорушение CRABP2 с NPPC , с зоной NPPC ⁺ / CRABP2 ⁻ ячейки (MG2) выше (рис.2г). Кроме того, Nppc коэкспрессировался с известным маркером твердой мозговой оболочки Fxyd5 ²⁵ (дополнительная рис. 3b, d). MG3 может представлять слой пограничных клеток твердой мозговой оболочки, который был описан с помощью электронной микроскопии в мозговых оболочках взрослых ^27,28 .

NPPC NPPC ⁺ / CRABP1 ^— Население выше гг. NPPC ⁺ / CRABP2 ⁺ клетки также были положительными для MATN4 и CTGF , маркеров, которые только перекрываются только с Nppc в MG2 (рис.2б, г, е, дополнительный рис. 3б, д). Экспрессия Matn4 не перекрывается с маркером MG3/MG4 Crabp2 (рис. 2e), а хондроциты в других срезах экспрессируют высокие уровни Matn4 , но не Ctgf (дополнительная рис. 3f). Мы также обнаружили некоторые клеток Matn4 , которые были низкими или отсутствовали для Nppc , и они были расположены ближе к шву и костям черепа, чем клетки Nppc -high (рис. 2f). Наш анализ UMAP показывает, что эти клеток Matn4 ⁺ / Nppc ^— представляют MG1 (рис.2б). MG1 экспрессировал более высокие уровни маркеров хондроцитов Col2a1 и Acan , чем MG2, но не на уровнях, наблюдаемых в настоящих хондроцитах (дополнительный рисунок 3g). Эти результаты согласуются с тем, что MG1/MG2 представляет популяцию периостальной твердой мозговой оболочки ²⁹ , предназначенную для формирования хряща, при этом популяция MG1 имеет более сильную хондрогенную программу. Эти данные показывают разнообразие типов мезенхимных клеток в мозговых оболочках, причем наиболее близкие к швам клетки имеют общие черты с хондрогенными клетками и, вероятно, функционируют как специализированная соединительная ткань, соединяющая кости черепа с мозговыми оболочками (рис.2г).

Разнообразие эктокраниальных слоев над венечным швом

Эктокраниальная мезенхима направляет миграцию ранних остеогенных клеток и помогает установить границы шва ^7,21,22 . В соответствии с анализом лобного шва мыши ³⁰ , мы идентифицировали кластеры, обогащенные маркерами дермы ( Ly6a , Dpt ; EC1-3) (рис. 1g, рис. 3a). Ly6a экспрессируется в гиподерме кожи новорожденных мышей ³¹ , и мы наблюдаем коэкспрессию Ly6a с дополнительными маркерами EC1-3, Pi16 и Dpt в одном слое мезенхимы над костями черепа. (Инжир.3б, г; Дополнительный рис. 4а, б). В нашей предыдущей работе была идентифицирована экспрессия Jag1 как в эктокраниальном слое, так и в клетках шовной мезенхимы ²² , а анализ scRNAseq показывает высокую экспрессию Jag1 в EC1 и, в меньшей степени, EC2 и EC3 (рис. 1g, Доп. Рис. 4д). Совместная экспрессия Jag1 с Pi16 подтверждает экспрессию Jag1 в гиподермальном слое (дополнительный рисунок 4f).

Рис. 3: Множественные эктокраниальные слои перекрывают венечный шов.

a Характерные графики генов, подтвержденные экспериментами in situ. b – e Комбинаторный анализ коронарных швов in situ для указанных маркеров на E15.5. Sp7 маркирует лобную (F) и теменную (P) кости. б Лы6а и Пи16 . c Ly6a и Dpt . Стрелка, Dpt ⁺ ; наконечник стрелы, Ly6a ⁺ / Dpt ⁺ . d Pi16 и C1qtnf3 . Стрелки, C1qtnf3 ⁺ слоя; Стрелка, Pi16 ⁺ слоя. e Tnmd и C1qtnf3 . Стрелка, C1qtnf3 ⁺ ; наконечник стрелы, Tnmd ⁺ / C1qtnf3 ⁺ . Asterisk, выражение Tnmd в MG1. f Модель, обобщающая паттерны экспрессии генов эктокраниальных слоев, полученные в результате анализа отдельных клеток.In situ проводили в трех биологических повторах. Шкала баров = 50 мкм; изображения в ( b – e ) имеют одинаковое увеличение.

В дополнение к гиподермальным слоям EC1-3 мы также отметили заметную популяцию EC4, определяемую экспрессией C1qtnf3 и Tnmd в нашем анализе UMAP (рис. 3a). Эксперименты in situ выявили два эктокраниальных слоя C1qtnf3 ⁺ по обе стороны от гиподермы Pi16 ⁺ (рис. 3d, дополнительная рис.4с). Однако только слой C1qtnf3 ⁺ между костями черепа и гиподермой экспрессирует Tnmd , что позволяет предположить, что это соответствует EC4, который мы называем «супрашовной мезенхимой» (рис. 3a, e, f; дополнительная рис. 4d). . Вполне вероятно, что внешний слой C1qtnf3 ⁺ был удален вместе с кожей во время вскрытия и поэтому не был включен в наш анализ одиночных клеток. Соответственно, Epha4 , который, как было показано, также проявляет эктокраниальную экспрессию ⁷ , был наиболее сильно экспрессирован в этом внешнем слое C1qtnf3 ⁺ и не особенно обогащен кластерами EC1-4 в анализе UMAP (дополнительная рис.4д, г). Таким образом, Jag1 и Epha4 , по-видимому, обозначают отдельные эктокраниальные слои.

Связкоподобная популяция над венечным швом сохраняется в зрелом возрасте

Тесно связана с C1qtnf3 ⁺ / Tnmd ⁺ слоем (EC4) и соединяет верхнюю часть лобной и теменной костей шва, мы наблюдали популяцию C1qtnf3 ^— / Tnmd ⁺ (LIG), обогащенную генами, связанными с развитием сухожилий/связок (например,г. SCX , TNMD , MKX , MKX , THBS2 , BGN , а также маркеры гладких мышц (например, ACTA2 , TAGLN , MyL9 ) (дополнительный фиг. 5А). Пере-кластеризация этого населения определила две транскрипционные отчетливые кластеры: MKX ⁺ / ACTA2 / ACTA2 ^— подмножество, похожее на сухожилия и связки и MKX ⁺ / ACTA2 ⁺ подмножество к гладкой мышце (дополнительный рис.5б, в). Двумя наиболее специфичными маркерами для LIG были Tac1 , ген, который кодирует четыре нейропептида, включая вещество P, участвующее в механоощущении сухожилий ³² , и Chodl , мембранный белок, экспрессирующийся в сухожилиях человека ³³ и конечности мыши ³⁴ (рис. 4а). Экспрессия Tac1 выборочно обогащается в подмножестве Mkx ⁺ / Acta2 ^— (дополнительный рисунок 5c).Гибридизация in situ для Tac1 и Chodl выявила сильно ограниченную экспрессию в мезенхиме, соединяющей края лобной и теменной костей над венечным швом (рис. 4b, d, дополнительная рис. 5d). Хотя эксперименты in situ были более широкими, они показали совместную экспрессию Scx и Tnmd в этом слое (рис. 4c; дополнительная рис. 5e, f), и мы наблюдали лишь минимальное перекрытие между экспрессией C1qtnf3 и Tac1 ( Дополнительный рис.5г). Т.о., кластер LIG представляет собой транскрипционно отличное и пространственно ограниченное подмножество эктокраниума, лежащего над коронарным швом. На постнатальных стадиях (3 недели, 3 месяца, 10 месяцев) анализ репортера сухожилия/связки Scx:GFP выявил длительное сохранение этой связки-подобной структуры (рис. 4e–h).

Рис. 4. Лигаментоподобная мезенхима над венечным швом.

a Характерные графики генов, подтвержденные экспериментами in situ. b – d Комбинаторный анализ коронарных швов на месте для указанных маркеров на E15.5. Sp7 маркирует лобную (F) и теменную (P) кости. Стрелки обозначают лигаментоподобную популяцию, а мезенхима шва звездочки слабо помечена Scx . e – g На указанных постнатальных стадиях Scx-GFP маркирует связку (стрелки) в положении, аналогичном эмбриональной лигаментоподобной популяции ( n  = 2 на стадию). Ядра помечены DAPI. h Модель, суммирующая расположение слоя LIG. cs = венечный шов.In situ проводили в трех биологических повторах. Шкала баров = 50 мкм; изображения ( b , c ) имеют то же увеличение, что и ( e – g ).

Различные траектории остеобластов в шве по сравнению с надкостницей

Шов является источником новых остеобластов для расширения костей черепа. Чтобы лучше понять траектории остеогенеза внутри и вокруг шва, мы определили шесть остеогенных кластеров (OG1, OG2, OG3, OG4, PO1, PO2) на основе экспрессии транскрипционных факторов остеобластов Runx2 и Sp7 ^{35, 36,37} , а также Dlx5 и Dlx6 ^38,39,40 , Ifitm5 и Dmp1 ^41,42  (доп. рис.6). Псевдовременной анализ этих кластеров с использованием Monocle3 предсказал, что OG1 будет самыми ранними клетками клона, за которыми следуют две пролиферативные ветви (PO1, PO2) и отдельные траектории OG2 и OG3, которые сходятся на кластере остеобластов OG4 (рис. 5a, b). Эти псевдовременные траектории отражались повышенной экспрессией Runx2 и Sp7 от OG1 до OG4 и накоплением маркеров зрелых остеобластов Ifitm5 и Dmp1 в OG4 (рис. 5c). Вымиренные кластерные маркеры включали ERG и Pthlh и PTLH и ALEF1 и Indba (OG2), MMP13 и PODNL1 и PODNL1 (OG3) и IFITM5 и DMP1 (OG4) (Рис. .5в, д). Псевдовременная визуализация показывает, что Erg (OG1) появляется раньше всех и отключается по мере того, как начинают проявляться Lef1 (OG2) и Mmp13 (OG3), после чего их исчезновение и постепенное появление Ifitm5 , Dmp1 и Sost (ОГ4) (рис. 5г).

Рис. 5: scRNA-seq захватывает различные подтипы остеобластов в области венечного шва.

a Анализ происхождения и ( b ) псевдовременной анализ подмножества остеобластов с использованием Monocle 3.Серые линии в ( a ) указывают родственную связь между ячейками на траектории. В ( b ) клетки дальше по траектории одиночной клетки обозначены постепенно более светлыми цветами. c Характерный график выбранных маркеров в пределах остеогенного подмножества. d Графики экспрессии выбранных генов в псевдовремени. e , j Графики признаков генов, подтвержденных экспериментами in situ. f – i , k Комбинаторный анализ коронарных швов на месте для указанных маркеров на E15.5. Sp7 маркирует лобную (F) и теменную (P) кости. f Ifitm5 и Сост . Стрелки указывают экспрессию Sp7 ⁺ в предполагаемых новообразованных остеобластах, а наконечник стрелки экспрессию Sost . г Lef1 и Inhba . Наконечники маркируют Lef1 ⁺ /Inhba ⁺ выражение у кончиков костей. ч Поднл1 и Ммп13 .Стрелками отмечены Podnl1 ⁺ /Mmp13 ⁺ экспрессия в надкостнице, удаленная от шва. i   Erg и Pthlh . Стрелки Erg ⁺ / Pthlh ⁺ экспрессия в шовной мезенхиме. к Шесть2 и Эрг . Стрелка указывает Six2 ⁺ / Erg ⁺ экспрессия в мезенхиме шва. l , m Иммуноокрашивание на Sp7 и tdTomato в коронарном шве Six2 :Cre;Ai9 на E16.5 ( n  = 3) и окрашивание DAPI коронарного шва Six2:Cre;Ai9 через 3 недели ( n  = 4). Звездочкой отмечены клетки над лобной костью. Стрелки, венечный шов. Стрелки, остеоциты. Пунктирные линии обводят кости. n Изображения венечного шва (CS, наконечник стрелки) и прилегающих костей из P7 Six2:CreERT2 ; Мышь R26-CAG-LSL-Sun1-sfGFP-myc, получавшая тамоксифен на P0 ( n  = 3). Преобразованные клетки демонстрируют сильный ядерный GFP; диффузный зеленый сигнал в костях — это аутофлуоресценция.Виды сверху — сверху черепа, с цифровыми поперечными сечениями шва, показанными ниже. o Модель, обобщающая паттерны экспрессии генов в развивающихся костях и мезенхиме венечного шва. In situ проводили в трех биологических повторах. Шкала баров = 50 мкм; изображения ( f – i ) с одинаковым увеличением.

Чтобы исследовать пространственные отношения между остеогенными кластерами, мы сначала оценили маркеры остеобластов (OG4). Маркер зрелых остеоцитов Sost , который маркирует самые старые клетки в псевдовремени, экспрессировался лишь в нескольких остеоцитах, удаленных от шва (рис.5f, дополнительный рис. 7a, e). Кроме того, мы наблюдали коэкспрессию Sp7 с Ifitm5 на большей части кости, за исключением ведущих кончиков и поверхностей костей, которые являются только Sp7 -положительными, что согласуется с ростом кости с обоих передних краев. и надкостничные поверхности (рис. 5f, дополнительная рис. 7a). Маркеры для OG2 ( Lef1 , Inhba ) и OG3 ( Podnl1 , Mmp13 ) проявляли экспрессию вдоль внешних доменов поверхности кости Sp7 ⁺ , что соответствовало идентичности преостеобластов.В то время как клетки Lef1 ⁺ / Inhba ⁺ были наиболее многочисленны на краях растущих костей вблизи шва, Podnl1 ⁺ / Mmp13 900 от шва (рис. 5g, h; дополнительный рис. 7b, c). Точно так же мы наблюдали экспрессию белка маркера остеобластов Cd200 (обогащенного OG4) в костях и Wnt-чувствительного фактора транскрипции Tcf7 (обогащенного OG2) вдоль кончиков костей и надкостничных поверхностей ^43,44,45 (рис.1g, дополнительный рисунок 8a–c). Таким образом, OG2 может представлять собой специализированные резидентные преостеобласты, расположенные в швах, а периостальные преостеобласты OG3 чаще обнаруживаются на поверхности костей.

Вклад

Six2 + остеопредшественников в остеоциты и мезенхиму постнатального шва

Псевдовременной анализ помещает OG1 в вершину траектории дифференцировки в венечном шве (рис. 5a–d). Проверка in situ показала коэкспрессию маркеров OG1 Six2 , Erg, и Pthlh (фиг.5e, j) в пределах шовной мезенхимы и проходит по краям кончиков лобной и теменной костей (рис. 5i, k, дополнительная рис. 7d). Интересно, что Erg распределялся вдоль костей асимметрично, с более сильным выражением над лобной и под теменной костью. Gli1 и Prrx1 показали аналогичную асимметричную экспрессию над лобной костью, а Six2 и Gli1 ниже теменной кости (рис. 5k, дополнительная рис. 9a, b).Эти находки подчеркивают асимметричное распределение самых ранних остеогенных клеток вокруг фронтов костей, что может играть роль в обеспечении более позднего воспроизводимого перекрытия теменной кости над лобной костью.

Маркеры пролиферативных кластеров PO1 и PO2 ( MKI67 , CENPF , TOP2A ) перекрываются с маркером OG1 ERG и OG2 маркеры LEF1 и Indba (рис. 1 г, рис. 5е Дополнительный рис. 7f). Проверка in situ выявила экспрессию Cenpf вокруг кончиков растущих костей и распространение в швы на E15.5, хотя по сравнению с Erg он практически отсутствует в центральной части шва (дополнительный рисунок 7g). Эти данные свидетельствуют о том, что, в отличие от остеопредшественников OG1, пролиферативные пре-остеобласты концентрируются на кончиках костей, что согласуется с предыдущими данными о пролиферативных остеогенных клетках на передних краях костей черепа ²⁰ . Пространственная организация между предполагаемыми предшественниками, резидентными швами преостеобластами и остеобластами была подтверждена двойным in situ между маркерами для OG1 ( Pthlh ), OG2 ( Podnl1 ) и OG4 ( Ifitm5 ) (рис.5o, дополнительный рис. 7h, i).

Затем мы исследовали эмбриональное и постнатальное мечение клеток шва с помощью Six2-Cre и репортера Ai9 TdTomato, поскольку Six2 коэкспрессируется с Erg в мезенхиме венечного шва на E14. 5 и E15.5. На E16.5 мы наблюдали маркировку мезенхимы в венечном шве, которая была асимметрично распределена над лобной и ниже теменной костью, что соответствует экспрессии Six2 (рис. 5l). Мы также наблюдали мечение остеобластов Sp7 ⁺ , преимущественно в лобной кости.Через 3 недели после рождения мы наблюдали обширный вклад клеток, меченных Six2-Cre , в мезенхиму коронарного шва, остеоциты лобной кости и остеоциты теменной кости вблизи шва (рис. 5m). Затем мы использовали условных мышей Six2 -CreERT2 в сочетании с репортером R26-CAG-LSL-Sun1-sfGFP-myc, управляющим ядерной экспрессией Sun1 -GFP, для оценки вклада Six2 ⁺ остеопредшественников в постнатальный период. мезенхима венечного шва.После лечения тамоксифеном на P0 мы наблюдали обширный вклад меченых клеток в мезенхиму коронального шва на P7, а также рассеянные клетки, связанные с растущими фронтами кости, которые мы интерпретируем как остеобласты (рис. 5n). Эти результаты согласуются с Six2 ⁺ эмбриональными предшественниками, дающими начало мезенхиме постнатального шва.

Перекрывающиеся типы клеток между венечным и лобным швами

Чтобы выяснить, как различия в клеточных популяциях могут лежать в основе различной чувствительности венечного и лобного швов к краниосиностозу, мы сравнили наш набор данных с недавно опубликованным набором данных для лобного шва ³⁰ .Совместная кластеризация нашего набора данных по венечному шву E17.5 с опубликованным набором данных по лобному шву E18.5 и анализ UMAP выявили 15 кластеров, каждый из которых содержал вклад обоих наборов данных (рис. 6a–c). Например, были идентифицированы сходные популяции гиподермы («EC1-3» в коронарной и «HD» во фронтальной), твердой мозговой оболочке («MG1-4» в сравнении с «DM») и остеобластов («OG4» в сравнении с «OB»). Подавляющее большинство маркерных генов для наборов данных венечного и лобного швов также демонстрировали схожую экспрессию в общих кластерах между наборами данных (рис.6г, д). Следует отметить, что клетки Acta2 ⁺ / Tagln ⁺ сформировали отдельный кластер (кластер 11) из клеток Tac1 ⁺ /Chodl ⁺ (кластер-5), что согласуется с повторным кластерным анализом клеток популяция LIG (дополнительная рис. 5a – c). Хотя ранее это не было разрешено в публикации о лобном шве, мы также отмечаем, что набор данных лобного шва содержит как OG3-подобные, так и OG2-подобные пре-остеобласты.

Рис. 6: Сравнение фронтальных и корональных наборов данных.

a UMAP-анализ остеогенных и мезенхимальных клеток из объединенных наборов данных E17.5 коронарной и E18.5 фронтальной. b , c Скопления клеток, разделенные по типу шва и помеченные соответствующими названиями. d , e Точечный график, показывающий пересечение маркеров кластеров из наборов данных коронарного шва (рис. 1g) и наборов данных лобного шва из Holmes et al. ³⁰ , сопоставляется с интегрированным набором данных, разделенным швом. Красная рамка помечает маркеры OG1. f – h Графики Violin показывают повышенную экспрессию маркеров OG1 Pthlh , Erg , Net1 в клетках кластера 1 из венечного шва по сравнению с лобным.

В то время как мы идентифицируем предполагаемые остеопредшественники как в коронарных, так и в лобных наборах данных швов, маркеры, используемые для их идентификации, по-видимому, различаются по уровням их экспрессии. В частности, мы находим более высокие уровни представительства и экспрессии Erg и Pthlh и, в меньшей степени, Net1 в остеопредшественниках коронарного шва по сравнению с лобным (рис.6г, е–з). Существуют также заметные различия в пространственном распределении остеопредшественников между швами. В отличие от асимметричного распределения остеопредшественников OG1 в коронарном шве, маркер остеопредшественников FS3 Npnt был ограничен медиальными аспектами лобного шва и внутри развивающейся кости ³⁰ . Существуют также различия в пространственном распределении других типов клеток. Надшовная популяция EC4 распределяется над костями в венечном шве, тогда как сопоставимая популяция FS1 находится в пределах лобного шва.Это сравнение указывает на то, что хотя сходные типы клеток, вероятно, присутствуют в обоих типах швов, экспрессия генов и, в частности, пространственная организация типов клеток специфичны для швов.

Сигнальные взаимодействия между слоями мезенхимы, полученные в результате анализа отдельных клеток

Чтобы получить представление о потенциальной передаче сигналов между остеогенными клетками и прилегающей эктокраниальной и менингеальной мезенхимой, мы исследовали наши наборы данных на предмет экспрессии лигандов и рецепторов (дополнительная рис.10а, б). В ОГ4 остеобласты мы наблюдали обогащению TGFB1 , BMP3 , BMP4 , IHH и PDGFA , и PDGFA , с IHH ⁴⁶ и PDGFA ^47,48 , известными, как известно, выделены остеобластами. В эктокрановых кластерах EC4 и LIG, которые расположены ближе всего к шову, мы обнаружили обогащение TGFB3 , FGF9 , FGF18 , WNT5A , WNT9A , WNT11 и IGF1 Ligands.В менингеальных скоплениях, ближайших к шву (MG1, MG2), мы также обнаружили экспрессию лиганда Tgfb3 и Igf1 , а также Tgfb2 , который, как ранее было показано, является критическим менингеальным фактором для морфогенеза шва ⁴⁹ . Взаимодействие, мы обнаружили экспрессию рецептора TGFβ TGFBR3 , рецепторы FGF FGFR1 и FGFR2 , рецепторы WNT FZD1 , FZD2 и FZD6 , IHH Receptor PTCH2 и PDGFA рецептор Pdgfra в различных остеогенных кластерах (дополнительная фиг.10б). Чтобы зафиксировать сигнальные взаимодействия в беспристрастном подходе, мы опросили наши данные с помощью пакета CellPhoneDB ⁵⁰ , оценив пары лиганд-рецептор между всеми кластерами (дополнительный рисунок 10c). Взаимодействия между остеогенными кластерами были особенно слабыми, что подчеркивает возможность взаимодействия остеогенных и неостеогенных типов клеток в регуляции коронарного шва. В соответствии с их пространственной организацией мезенхимальные популяции, расположенные ближе всего к шву (EC4 вверху, MG1/MG2 внизу), имели самые сильные взаимодействия с остеогенными клетками.Из взаимодействий лиганд-рецептор, которые были идентифицированы между соседними неостеогенными и остеогенными кластерами, несколько путей имеют отношение к развитию коронарного шва, включая передачу сигналов Fgf, Tgfβ и Wnt ⁵¹ (дополнительная рис. 11).

Обогащение экспрессии генов коронарного синостоза в кластерах остеогенных клеток

Чтобы определить, сливаются ли гены, лежащие в основе краниосиностоза у людей ^51,52,53 , в определенном типе клеток, мы нанесли на карту гены коронарного синостоза в нашем наборе данных.Мы отметили, что 9/16 генов коронарного синостоза были обогащены несколькими остеогенными кластерами, в частности PO1 и PO2, что свидетельствует о нарушении регуляции дифференцировки и/или пролиферации остеобластов как общего механизма коронарного синостоза. Например, два гена коронального синостоза CDC45 и ESCO2 и ESCO2 и ASCO2 , кодирование факторов репликации ДНК ^54,55 , сильно обогащены в PO1, и FGFR1 , FGFR2 , TCF12 , Twist1 и Zeb2 были обогащены как пролиферативными, так и остеогенными кластерами, в частности кластером предшественников остеогенеза OG1 и резидентным кластером OG2.Чтобы оценить, имеет ли набор генов коронального синостоза неслучайное распределение по типам клеток шва, мы оценили распределение средней экспрессии набора корональных генов по сравнению с рандомизированным набором генов между сгруппированными остеогенными, эктокраниальными и менингеальными кластерами. Гены коронарного синостоза были обогащены остеогенными кластерами и, в некоторой степени, менингеальными кластерами (рис. 7b, дополнительная рис. 12a). Этот анализ демонстрирует предпочтительное обогащение генов, связанных с коронарным синостозом, в остеогенных кластерах.

Рис. 7: Обогащение и потребности генов коронарного синостоза для остеогенных клеток.

a Точечный график генов, ассоциированных с синостозом венечного шва. Размер и интенсивность окраски точек соответствуют проценту клеток внутри каждого кластера, экспрессирующих указанный ген, и среднему уровню экспрессии. b Оценка модуля для генов коронарного синостоза, нанесенная на остеогенную/мезенхимальную субпопуляцию UMAP. c – i Комбинаторный анализ коронарных швов in situ для указанных маркеров на E14.5 или Е15.5. Sp7 маркирует лобную (F) и теменную (P) кости. c , d Экспрессия Twist1 перекрывается с маркерами PO1 ( Cenpf ) и OG1 ( Erg ) в мезенхиме коронарного шва мышей E15.5 дикого типа. e – i , экспрессия маркеров OG1 Erg и Six2 утрачена в шовной мезенхиме (стрелки) Twist1 ^+/− ; Tcf12 ^+/- мыши, но маркер EC1-3 Pi16 и маркер LIG Tac1 не затронуты.In situ проводили в трех биологических повторах. Шкала баров = 50 мкм; изображения в ( c – i ) имеют одинаковое увеличение.

Избирательная потеря остеопредшественников в модели синдрома Сэтре-Чотцена на мышах

Ранее мы предположили, что дисфункция предшественников играет центральную роль в коронарном синостозе, наблюдаемом у Twist1 ^+/- ; Tcf12 ^+/- мышиная модель синдрома Saethre-Chotzen, хотя у нас не было четких маркеров для определения эмбриональных остеопредшественников в этих исследованиях ^9,20 .Наблюдаемое обогащение Twist1 и Tcf12 в остеогенных кластерах, включая OG1, предполагает, что эти транскрипционные факторы могут регулировать количество остеопредшественников. Кроме того, проверка in situ подтвердила совместную экспрессию Twist1 с пролиферативным маркером Cenpf и маркером OG1 Erg в шовной мезенхиме, при этом Twist1 демонстрирует ту же асимметричную экспрессию над лобной костью, что и Erg . 7d, e, дополнительный рис.12б, в). В Twist1 ^+/- ; Tcf12 ^+/- мышей, мы наблюдали сниженную экспрессию Erg на E14.5 и Six2 на E14.5 и E15.5 в домене венечного шва, но эктокраниальную экспрессию Pi16 и

9 Tac не пострадали (рис. 7e–i). Эти находки указывают на специфическую роль Twist1 и Tcf12 в спецификации и/или поддержании предшественников коронарного шва OG1 уже на стадии E14.5.

Частицы шовного материала вызывают выраженную воспалительную реакцию в модели синовиального воздушного мешка мышей | Journal of Orthopedic Surgery and Research

Несмотря на то, что это серьезная причина заболеваемости после артроскопической хирургии плеча, мало что известно об этиологии и молекулярных путях, лежащих в основе PAGCL.Hedbom и Hauselmann предполагают, что хондролизу способствуют молекулярные и биохимические сигналы, поступающие от воспаленной синовиальной оболочки [11]. Впоследствии воспалительная реакция, вызванная шовным материалом или остатками его износа, может играть потенциальную роль в развитии PAGCL.

В этом исследовании мы изучили биологическую реакцию синовиальной ткани на обычно используемый ортопедический шовный материал. Ограничением этого исследования является то, что были протестированы только три типа шовного материала и только Fibrewire был исследован в форме частиц.Эти три шва были выбраны, так как считалось, что они отражают наиболее часто используемые швы в современной хирургической практике плеча. Однако важно отметить, что аналогичная воспалительная реакция может наблюдаться при использовании других шовных материалов, которые не тестировались в нашем исследовании. Как было отмечено выше, частицы износа FibreWire были выбраны в свете предыдущих исследований, демонстрирующих повышенный абразивный износ по сравнению с Ethibond и Orthocord [4]. В идеале, будущие исследования должны изучить биореактивность частиц износа для всех исследуемых шовных материалов, поскольку шовный материал с другим составом материала может вызывать различную реакцию хозяина в форме частиц.

Это исследование подтвердило, что нити Ethibond, FibreWire и Orthocord стимулируют воспалительную реакцию в синовиальной ткани, о чем свидетельствует наличие многоядерных гигантских клеток. Кроме того, это исследование продемонстрировало значительно более сильную воспалительную реакцию на частицы износа FibreWire по сравнению с интактным FibreWire. Кроме того, значительное увеличение продукции ММР в ответ на частицы износа FibreWire по сравнению с интактным FibreWire, продемонстрированное в этом исследовании, указывает на потенциальный этиологический путь развития хондролиза.[3]. Однако в исследовании Carr et al. проверялся только неповрежденный шовный материал, а не фрагменты износа шовного материала. Кроме того, тесты проводились на спинной фасции кролика, которая не воссоздает синовиальную ткань, полученную с использованием мышиной модели воздушного мешка.Соответственно, результаты настоящего исследования могут более точно отражать биологическую реакцию на шовный материал, особенно в синовиальных пространствах, таких как суставы и сумки.

Усиленная воспалительная реакция на частицы износа из полимеров, обычно используемых в ортопедической хирургии, была ранее продемонстрирована Wooley et al. [5]. Это исследование показало, что частицы сверхвысокомолекулярного полиэтилена, полиметилметакрилата, кобальт-хрома и титанового сплава вызывают значительное увеличение количества воспалительных клеток и воспалительных цитокинов (IL-1, TNFα) при имплантации в воздушный мешок мыши.Настоящее исследование подтверждает, что частицы износа нити FibreWire дают гистологические признаки воспалительной реакции. Более того, этот воспалительный ответ значительно сильнее, чем в ответ на неповрежденный шов FibreWire, о чем свидетельствует статистически значимое увеличение количества многоядерных гигантских клеток. Насколько нам известно, настоящее исследование является первым, демонстрирующим этот вывод.

В этом исследовании мы изучили активность нескольких подтипов ММП: ММП-1 (коллагеназа 1), ММП-2 (желатиназа А), ММП-3 (стромелизин-1), ММП-9 (желатиназа В) и ММП -13 (коллагеназа 3).Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что некоторые из этих подтипов ММР могут опосредовать деструкцию суставного хряща, инициируя протеолиз белков внеклеточного матрикса, которые регулируют биомеханические реакции суставного хряща [6, 12, 13]. Каждый подтип MMP был связан с определенной ролью в хондролизе. MMP-1 значительно увеличивается при хондролизе, и было показано, что он разрушает внеклеточный матрикс хряща путем расщепления коллагена II типа. ММР-2 и ММР-9 разрушают денатурированный коллаген II типа, который первоначально был расщеплен активированной ММР-1 [6].Они также разрушают аггрекан, крупный протеогликан, критически важный для структуры и механических свойств хряща. Было показано, что MMP-3 разрушает протеогликаны хряща, а также связывающий белок, который стабилизирует нековалентные взаимодействия между аггреканом и гиалуроновой кислотой. MMP-13 может разрушать как коллаген II типа, так и аггрекан. В настоящем исследовании использовались иммуногистохимические методы для количественной оценки активности этих подтипов матриксных металлопротеиназ в группах интактных частиц FibreWire и FibreWire через 4 недели после имплантации.В группе, получавшей частицы FibreWire, наблюдалось значительно большее производство MMP-1, MMP-2, MMP-9 и MMP-13 по сравнению с группой, принимавшей интактный FibreWire. Двукратное увеличение также отмечено для ММП-3 в группе частиц. Хотя значение p , равное 0,058, приближалось к значимости, возможно, что для выявления статистически значимой разницы мог потребоваться больший размер выборки. Наши результаты подтверждают мнение о том, что несколько подтипов MMP образуются в результате повышенного иммунного ответа на частицы износа FibreWire.Мы предполагаем, что это, вероятно, связано с тем, что более мелкие частицы, связанные с остатками износа, предлагают большую площадь поверхности для прикрепления макрофагов и инициирования воспалительной реакции. Предыдущие исследования показали, что шовный материал может увеличить продукцию ММП в сухожилиях [14]. Однако, насколько нам известно, это первое исследование, демонстрирующее увеличение экспрессии ММР в синовиальной ткани, подвергшейся воздействию как неповрежденного шовного материала, так и частиц износа. Это открытие дает представление о возможном молекулярном механизме, с помощью которого шовный материал может способствовать развитию хондролиза.

В нашем исследовании мы не пытались количественно определить экспрессию провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1β (ИЛ-1β), ИЛ-6 и фактор некроза опухоли α (ФНОα). Предыдущее исследование Lock et al. продемонстрировали, что FibreWire значительно увеличивал экспрессию TNFα in vitro по сравнению с контролем, но не других провоспалительных цитокинов, включая IL-1α, IL-1β или IL-8 [15]. Существует значительное количество экспериментальных и клинических доказательств того, что эти провоспалительные цитокины имеют решающее значение в опосредовании воспаления и разрушения хряща при остеоартрите человека путем усиления экспрессии генов и синтеза подтипов ММР [16,17,18].Вероятно, этот каскад событий связан с PAGCL.

Наше исследование имеет ряд ограничений. Использование подкожного воздушного мешка у мышей для исследования биореактивности различных хирургических материалов в синовиальной ткани является хорошо зарекомендовавшей себя моделью [19, 20]. Однако неизвестно, полностью ли применимы результаты к людям, и поэтому это может ограничить применение исследования клинической ситуацией PAGCL. Во-вторых, мы изучали воспалительную реакцию в двух временных точках.Первая временная точка в 1 неделю была выбрана для исследования начальной реакции на инородный материал, в то время как 4-недельная временная точка считалась адекватной для имитации более хронических условий. Однако в клинических условиях у большинства пациентов, у которых развивается PAGCL, симптомы появляются примерно через 3 месяца после артроскопии [2]. Таким образом, в будущих исследованиях было бы полезно изучить воспалительную реакцию в течение более длительного периода. Наконец, как обсуждалось выше, будущие исследования должны изучить биореактивность всех швов, обычно используемых в артроскопической хирургии плеча, и частиц их износа.

Эти результаты имеют важное клиническое значение для хирургов-ортопедов. Во-первых, это исследование подчеркивает важность предотвращения повреждения шовного материала во время артроскопических процедур. Хирурги должны внимательно следить за изношенностью или избытком шовного материала во время операции, использовать острые инструменты при разрезании швов и разумно использовать толкатель узлов из-за его склонности вызывать истирание швов. Кроме того, эти результаты имеют значение для хирургической техники и дизайна шовного анкера, при этом исследование Bardana et al. продемонстрировало, что истирание швов значительно снижается, когда манипуляции с нитями выполняются в соответствии с ушком анкера с минимальным вращением или углом наклона [21].Кроме того, опасения по поводу остатков шовного материала могут сделать использование безузловых анкерных систем предпочтительнее, так как они препятствуют перемещению шовного материала через ушко и избегают завязывания узлов с помощью толкателя узлов, тем самым сводя к минимуму истирание.

Рекомбинантный мышиный периостин улучшает сращение коронарных швов у мышей Twist1+/− | Journal of Translational Medicine

Twist1

^+/− мыши

Модель SCS Twist1 ^+/− мыши была предоставлена ​​детской больницей Сиэтла (Сиэтл, штат Вашингтон, США).Мышей Twist1 ^+/- скрещивали с мышами дикого типа (Twist1 ^+/+ ) для получения потомства, используемого в этом исследовании. Генотипирование хвостовой ДНК использовали, чтобы отличить мутантное потомство от потомства дикого типа с помощью анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность праймеров TWSIT1 представлена ​​в таблице 1. Мышей умерщвляли смещением шейных позвонков. Twist1 ^+/- мыши продемонстрировали значительные черепно-лицевые аномалии, о чем свидетельствуют исследования с помощью микрокомпьютерной томографии (КТ) (дополнительный файл 1: рисунок S1).Для фенотипического анализа использовали однодневных мышей Twist1 ^+/- и контрольных однопометников или мышей дикого типа в течение 1 дня. Мыши были размещены в помещении для животных Шанхайской девятой народной больницы (Шанхай, Китай), и все протоколы были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Шанхайской девятой народной больницы.

Таблица 1 Окончательное количество образцов, использованных для каждого экспериментального условия

Выделение и культивирование клеток, полученных из шовного материала

Клетки, полученные из коронарного шва, были собраны у мышей Twist1 ^+/- в постнатальный день 1.Все мыши были самцами. Корональные швы с костными краями толщиной 500 мкм рассекали с большой осторожностью для удаления всей твердой мозговой оболочки и перикраниальной ткани под анатомическим микроскопом (Olympus, Токио, Япония) [12]. Эксплантаты швов культивировали в α-минимальной основной среде с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco, Gaithersburg, MD, USA), 100 ед/мл пенициллина (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco , Гейтерсберг, Мэриленд, США). Клетки культивировали при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ , и все эксперименты проводили при плотности посева 50 000 клеток/см ² .Использовали только полученные из швов клетки пассажа 1.

Культивированные клетки, полученные из шовного материала, обрабатывали следующими различными концентрациями рекомбинантного мышиного периостина: 0, 50, 100 и 200 мкг/л. Окончательное количество образцов, использованных для каждого эксперимента, представлено в таблице 1.

Все процессы клеточной остеогенной дифференцировки и минерализации матрикса инициировали через 24 часа после посева путем замены среды свежей средой с добавлением 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты ( Сигма-Олдрич, Св.Луи, Миссури, США) и 10 мМ β-глицерофосфата (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Среду меняли один раз каждые 3 дня и клетки культивировали в течение 21 дня. После окончания культивирования клетки использовали только для окрашивания ализариновым красным, иммунофлуоресцентного окрашивания и получения рибонуклеиновой кислоты (РНК) и белка.

Анализ пролиферации клеток

Пролиферацию клеток определяли с использованием набора для подсчета клеток-8 (CCK-8; Beyotime, Шанхай, Китай). Клетки, полученные из швов (2000 клеток на лунку), высевали в 96-луночные планшеты.В качестве контрольных использовали лунки со стандартной средой без клеток. Планшеты инкубировали в течение 1, 3, 5 и 7 дней. Затем добавляли 20 мкл раствора красителя CCK-8 и инкубировали в течение 4 часов при 37 °C. После 4 часов инкубации значения оптической плотности измеряли с помощью устройства для чтения микропланшетов (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Все анализы были выполнены в пяти экземплярах и повторены с использованием трех образцов клеток.

Анализ клеточной миграции

Для сравнения миграционной способности клеток, полученных из швов, обработанных различными концентрациями рекомбинантного мышиного периостина, использовали анализ соскоба монослоя.Клетки культивировали на 6-луночных планшетах; при достижении 90% слияния в 6-луночных планшетах монослой клеток соскабливали стерильным наконечником пипетки объемом 200 мкл. Культуры промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления отслоившихся клеток и добавляли различные концентрации рекомбинантного мышиного периостина. Фотографии были сделаны сразу после расчесывания и снова через 24 часа. Сфотографированные области были количественно оценены с помощью компьютерного анализа изображений с использованием Image-Pro ^® Plus 6.0 (Media Cybernetics, Роквилл, Мэриленд, США). Результаты представлены в процентах от площади царапины, заполненной клетками, полученными из шовного материала. Данные были получены из пяти случайно выбранных полей высокой мощности.

Для анализа использовалась система Transwell (размер пор 8 мкм; Gibco, Gaithersburg, MD, USA). Вкратце, клетки собирали и высевали в верхнем отделении камеры в 24-луночные планшеты, используя в общей сложности 10 000 клеток в 0,1 мл бессывороточной модифицированной Дульбекко среды Игла с рекомбинантным мышиным периостином (0, 50, 100 и 200). мкг/л), а нижняя лунка заполнена 0.6 мл модифицированной Дульбекко среды Игла плюс 10 % эмбриональной бычьей сыворотки. Затем клетки инкубировали в течение 24 часов. Затем ватным тампоном удаляли не мигрировавшие клетки с верхней поверхности мембраны, а мигрировавшие клетки с нижней поверхности фильтрующей мембраны фиксировали в 4% параформальдегиде и окрашивали 4′,6-диамидино- 2-фенилиндол (DAPI). Количество мигрировавших клеток получали путем подсчета окрашенных клеток в пяти случайно выбранных полях под микроскопом (Olympus, Токио, Япония).

Окрашивание ализариновым красным

Через 21 день культивирования в остеогенной среде клетки фиксировали метанолом в течение 20 мин и окрашивали 10% раствором ализаринового красного. Затем минерализованные узелки идентифицировали как красные пятна на чашке для культивирования.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Клетки, полученные из нити, сначала культивировали на покровных стеклах в течение 1 дня, а затем фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. После промывки в PBS клетки обрабатывали 0.5% Triton X-100 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) в течение 15 минут при комнатной температуре и инкубировали с нормальной козьей сывороткой в ​​течение 60 минут при 37 °C. Затем образцы инкубировали в кроличьем антителе против мышиного коллагена типа I (COL-1) (1:50; Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США) при 4°C в течение ночи. Клетки трижды промывали PBS и инкубировали со вторичным антителом (козье антикроличье; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. После тщательной промывки в PBS клетки монтировали с помощью DAPI (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США).Микрофотографии были сделаны с помощью микроскопа Nikon E600 (Nikon, Токио, Япония). Анализ проводился с использованием программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США) для оценки различий между 4 группами.

Анализ активности щелочной фосфатазы

Активность внутриклеточной ЩФ измеряли с помощью набора для анализа активности ЩФ (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) с методом мечения ферментов в соответствии с инструкциями производителя. Измерения сравнивали со стандартом щелочной фосфатазы и нормализовали, используя уровни общего белка, полученные с помощью набора для анализа белка BCA (Biomiga, Сантьяго, США).

Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК экстрагировали из шовных тканей или культивируемых клеток мышей с использованием реагента TRIzol™ (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), а комплементарную ДНК синтезировали из 1 мкг общей РНК на образец с использованием обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (Takara Bio Inc., Кусацу, Япония). Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл с 4 мкл хлорида магния (MgCl ₂ ), 4 мкл 5× буфера, 2 мкл дезоксирибонуклеотидтрифосфата, 0.5 мкл ингибитора РНКазы, 1 мкл олиго-(dT) и 1 мкл обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц с использованием дважды дистиллированной воды (ddH ₂ O) до конечного объема. Смесь инкубировали при 30°С в течение 10 мин, 45°С в течение 60 мин, 98°С в течение 5 мин и 5°С в течение 5 мин.

Разработанные праймеры для анализа количественной ПЦР в реальном времени перечислены в таблице 2. ПЦР проводили с инкубацией при 95 °C в течение 3 минут, за которыми следовали 30 циклов (30 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 45 с при 72 °C) и последующее прекращение 5-минутным удлинением при 72 °C и хранением при 4 °C до анализа.Продукты ПЦР разделяли с использованием 0,75% агарозных гелей в трис-ацетат-этилендиаминтетрауксусном буфере и затем фотографировали в ультрафиолетовом свете. Ген β-актина использовали в качестве внутреннего контроля. Эксперименты были повторены на трех образцах тканей.

Для количественной ПЦР комплементарную ДНК амплифицировали с использованием Power SYBR ^® Green PCR Master Mix (2×) (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) в термоциклере реального времени (Stratagene Mx3000PTM QPCR System, Palo Alto, Калифорния, США).кПЦР проводили в трех повторностях для каждого образца, и эксперименты повторяли с тремя образцами тканей. Экспрессию генов нормализовали по экспрессии β-актина с помощью метода 2 ^-△△C(t) [13].

Вестерн-блоттинг

Использование равных количеств белковых экстрактов в лизирующем буфере, содержащем 100 мМ трис-хлористоводородной кислоты, рН 9,0, 200 мМ хлорида калия, 25 мМ эктазовой кислоты, 36 мМ MgCl ₂ 2% дезоксихолевой кислоты и 10% дитиотреитола об/об. AS для β-катенина, экстракцию и выделение ядерного и цитоплазматического белка проводили в соответствии с протоколами набора для выделения ядерных и цитоплазматических белков (Beyotime, Цзянсу, Китай).Сначала клетки центрифугировали в течение 5 минут при 1200 об/мин при 4 °C, а осадок растворяли с помощью агента для экстракции цитоплазматического белка А с добавлением фенилметансульфонилфторида (ФМСФ). После встряхивания в течение 5 с пробирки инкубировали в течение 10–15 мин на льду для ускорения лизиса. Затем добавляли агент для экстракции цитоплазматического белка B, встряхивали в течение 5 с, и каждый образец инкубировали на льду в течение 5 с. Затем образцы центрифугировали в течение 5 мин при 14 000 g при 4 °C и сразу же замораживали супернатант, состоящий из цитозольной фракции, для дальнейшего анализа.Осадок ресуспендировали в агенте для экстракции ядерного белка с добавлением PMSF. Наконец, после встряхивания пробирок от 15 до 20 раз в течение 30 минут и центрифугирования в течение 10 минут при 14 000 г были получены супернатанты, содержащие ядерные экстракты.

Подготовленный белок подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и затем переносили на поливинилидендифторидные мембраны. Мембраны инкубировали с первичными антителами, а затем с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Уэст-Гроув, Пенсильвания, США). Белковые полосы в конечном итоге визуализировали с использованием набора для обнаружения улучшенной хемилюминесценции (Amersham, Little Chalfont, UK). Первичные антитела против щелочной фосфатазы (ALP), костного сиалопротеина (BSP), COL-1, остеокальцина (OCN), транскрипционного фактора 2, связанного с рантами (RUNX-2), Wnt-7b, Wnt-3a, Wnt-1 и Все β-катенины были приобретены у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США). Интенсивность полос определяли количественно с использованием программного обеспечения Image J (версия 2.1.4.7, NIH, США).

Лечение in vivo

Весь уход и процедуры для исследуемых мышей проводились в соответствии с Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Шанхайской девятой народной больницы.Возраст мышей был постнатальным 1 день, все мыши были самцами. В коронарные швы мышей Twist1 ^+/- (n = 10) ежедневно вводили подкожно 200 мкл коллагена, смешанного с 1,0 мг/кг периостина. В коронарные швы мышей Twist1 ^+/- (n = 10) ежедневно вводили подкожно 200 мкл коллагена. Для доставки периостина использовали автоматический микроинжектор (Hamilton, Bonaduz, Швейцария) и однократную инъекцию 5 мкл. В венечные швы мышей дикого типа (n = 10) ежедневно вводили подкожно 200 мкл коллагена с периостином.Все животные получали подкожные инъекции в течение 3 недель.

Микрокомпьютерная томография и анализ плотности кости коронарного шва

Все животные были умерщвлены передозировкой пентобарбитала через 3 недели для получения черепов. После извлечения образцы фиксировали в 10% формалине не менее 48 часов. Целые черепа сканировали с помощью микро-КТ (Scanco Medical, Бассерсдорф, Швейцария). Параметры сканирования были установлены на 70 кВ и 114 мкА с временем экспозиции 400 мс и разрешением 20 мкм.Коронарные швы мышей были выбраны в качестве области интереса (ROI), а BV/TV (объемная доля кости) была рассчитана с использованием пакета системного программного обеспечения микро-КТ. Трехмерные изображения образцов реконструировали с помощью программного обеспечения Mimics 10.0 (Materialise NV, Лёвен, Бельгия).

Гистология

После визуализации с помощью микро-КТ черепа изолировали и фиксировали в 4% параформальдегиде в PBS в течение 24 ч при 4 °C, а затем обезвоживали в последовательной серии этанола, заливали в парафин и делали срезы при интервалы 7 мм.После депарафинизации и регидратации срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Осака, Япония).

Статистический анализ

После подтверждения нормального распределения данных однородность дисперсии была проверена с помощью критерия Левена. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD), а статистический анализ был выполнен с использованием статистического программного обеспечения Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, версия 19.0; IBM Corp., Армонк, штат Нью-Йорк, США). Двусторонний критерий Стьюдента t использовали для сравнения двух групп, а критерий дисперсионного анализа использовали для сравнения трех или более групп. Различия со значением p < 0,05 считались статистически значимыми. Графики были созданы с помощью GraphPad Prism v6.00 для Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Анализ одиночных клеток определяет ключевую роль Hhip в развитии коронарного шва у мышей — Penn State

TY — JOUR

T1 — Анализ одиночных клеток определяет ключевую роль Hhip в развитии коронарного шва у мышей

AU — Holmes, Грег

AU — Гонсалес-Райх, Ана С.

AU — Saturne, Madrikha

AU — Motch Perrine, Susan M.

AU — Zhou, Xianxiao

AU — Borges, Ana C.

AU — Shewale, Bhavana AU

0 -Joan Tnier

AU — Zhang, Bin

AU — van Bakel, Harm

AU — Jabs, Ethylin Wang

N1 — Информация о финансировании: Эта работа финансировалась грантами NIH U01DE024448 (грант FaceBase Spoke для G.H., H.v.B. и E.W.J.), R03DE026814 (для B.Z. и E.W.J.), R01DE027677 (для J.TR), P01HD078233 (для E.W.J. и J.T.R.) и R01DE030596 (для H.v.B., E.W.J. и G.H.). Эта работа была частично поддержана за счет вычислительных ресурсов и опыта персонала, предоставленного отделом научных вычислений Медицинской школы Икана на горе Синай. Авторское право издателя: © 2021, Автор(ы).

PY — 2021/12

Y1 — 2021/12

N2 — Черепно-лицевое развитие зависит от формирования и сохранения швов между костями черепа. В швах рост происходит на остеогенных фронтах по краю каждой кости, а шовная мезенхима разделяет соседние кости.Здесь мы проводим одноклеточный анализ РНК-seq эмбрионального коронарного шва мыши дикого типа, чтобы определить его популяционную структуру. Семь популяций на E16.5 и девять на E18.5 включают шовную мезенхиму, остеогенные клетки и ассоциированные популяции. Экспрессия Hhip, ингибитора передачи сигналов hedgehog, маркирует мезенхимальную популяцию, отличную от популяции др. нейрокраниальных швов. Отслеживание неонатальной популяции, экспрессирующей Hhip, показывает, что клетки-потомки персистируют в венечном шве и способствуют росту кости свода черепа.В коронарных швах Hhip-/- на E18.5 остеогенные фронты близко прилегают друг к другу, а мезенхима шва истощена с усилением передачи сигналов hedgehog по сравнению с таковыми у дикого типа. В совокупности эти данные демонстрируют, что Hhip необходим для нормального развития коронарного шва.

AB — Черепно-лицевое развитие зависит от образования и сохранения швов между костями черепа. В швах рост происходит на остеогенных фронтах по краю каждой кости, а шовная мезенхима разделяет соседние кости.Здесь мы проводим одноклеточный анализ РНК-seq эмбрионального коронарного шва мыши дикого типа, чтобы определить его популяционную структуру. Семь популяций на E16.5 и девять на E18.5 включают шовную мезенхиму, остеогенные клетки и ассоциированные популяции. Экспрессия Hhip, ингибитора передачи сигналов hedgehog, маркирует мезенхимальную популяцию, отличную от популяции др. нейрокраниальных швов. Отслеживание неонатальной популяции, экспрессирующей Hhip, показывает, что клетки-потомки персистируют в венечном шве и способствуют росту кости свода черепа.В коронарных швах Hhip-/- на E18.5 остеогенные фронты близко прилегают друг к другу, а мезенхима шва истощена с усилением передачи сигналов hedgehog по сравнению с таковыми у дикого типа. В совокупности эти данные демонстрируют, что Hhip необходим для нормального развития коронарного шва.

UR — http://www.scopus.com/inward/record.url?scp=85120933773&partnerID=8YFLogxK

UR — http://www.scopus.com/inward/citedby.url?scp=85120933773&partnerID=8YFLogxK

У2 — 10.1038 / S41467-021-27402-5-021-27402-5

DO — 10.1038 / S41467-021-27402-5

м3 — Статья

C2 — 34880220

AN — Scopus: 85120933773

VL — 12

Jo — Природа коммуникации

JF-Nature Communications

SN-2041-1723

IS-1

M1-7132

ER-

.